Análise de expressão do gene ADAM23 em tumores do sistema nervoso central (SNC) e estudo de sua função em gliomas e em melanomas / Analysis of ADAM23 gene expression in tumors of the central nervous system (CNS) and study of its function in melanoma and glioma

O gene ADAM23 está epigeneticamente silenciado em tumores de mama de estágios mais avançados e o seu silenciamento nesses tumores confere ao paciente um maior risco de desenvolvimento de metástases e um pior prognóstico. O silenciamento do gene ADAM23 na linhagem tumoral de mama MDA-MB-435 reduz a capacidade proliferativa e aumenta a capacidade migratória e invasiva das células em modelo tridimensional de cultura. No entanto, paradoxalmente, o silenciamento do gene ADAM23 nessa linhagem reduz a capacidade tumorigênica e metastática das células em ensaios in vivo utilizando animais imunodeficientes. Ensaios subsequentes utilizando misturas de células positivas e negativas para a expressão de ADAM23 revelaram que as células negativas estimulam a proliferação, migração e invasão das células positivas e que a heterogeneidade tumoral em relação à expressão de ADAM23 é importante para a disseminação e colonização metastática. Este trabalho teve como objetivo validar a associação entre o silenciamento do gene ADAM23 em tumores primários e a progressão tumoral, e também encontrar um modelo celular alternativo para a realização de ensaios funcionais que comprovassem o papel do gene ADAM23 na proliferação, migração, e invasão celular, bem como a existência de interação celular entre células ADAM23 positivas e negativas. A análise da expressão do gene ADAM23 em amostras de gliomas de diferentes estágios através de PCR em Tempo Real revelou que a expressão desse gene diminui ao longo da progressão tumoral e está bastante reduzida em tumores de grau avançado. Porém, ao contrário do observado em tumores de mama, o silenciamento do gene ADAM23 em gliomas não é causado por hipermetilação de sua região promotora nem por mutações em sua região codificante, ou perda de heterozigose. Infelizmente, não foi possível selecionar clones derivados da linhagem celular de glioblastoma U87MG com silenciamento estável do gene ADAM23 para a realização de ensaios funcionais. Aparentemente, o silenciamento de ADAM23 nessa linhagem resulta na parada do ciclo celular na fase G0/G1, impedindo a seleção de clones com silenciamento estável do gene. O mesmo fenômeno não foi observado na linhagem de melanoma SKmel-37, permitindo a seleção de clones com silenciamento estável de ADAM23 e a realização de ensaios funcionais. Curvas de proliferação em monocamada e ensaios de incorporação de MTT em modelo tridimensional in vitro demonstraram que o silencimento de ADAM23 na linhagem SKmel-37 diminui sua taxa de proliferação em 20-50%. Ensaios de citometria de fluxo demonstraram que o silenciamento de ADAM23 interfere na expressão das integrinas αvß3 e αvß5 na membrana celular, resultando em diminuição de 50% na afinidade aos ligantes de matriz e aumento significativo na capacidade de migração e invasão no colágeno. Ensaios in vitro e in vivo utilizando misturas de células SKmel-37 ADAM23 positivas e negativas também confirmaram a existência de interação entre os dois subtipos celulares. Ensaios in vitro de migração e invasão no colágeno revelaram que células ADAM23 negativas induzem a migração e a invasão de células positivas e, em ensaios de tumorigienese in vivo, observamos que os tumores formados a partir da injeção de uma mistura de células positivas e negativas apresentam crescimento semelhante ao dos tumores formados a partir da injeção de células ADAM23 positivas

The ADAM23 gene is epigenetically silenced in breast tumors of more advanced stages and its silencing in these tumors gives the patient a greater risk of developing metastasis and a worse prognosis. The ADAM23 gene silencing in the MDA-MB-435 breast tumor cell line reduces the proliferative capacity and increases migratory and invasive abilities of cells in three-dimensional culture models. Yet, paradoxically, the ADAM23 gene silencing in this line reduces tumorigenic and metastatic abilities of cells in in vivo assays using immunodeficient animals. Subsequent tests using ADAM23 positive and negative cells mixtures revealed that negative cells stimulate proliferation, migration and invasion of positive cells and the heterogeneity of ADAM23 expression in tumors is important for the spreading and metastatic colonization. This study aimed to validate the association between ADAM23 gene silencing in primary tumors and tumor progression as well as find an alternative cellular model for performing functional tests to prove the role of the ADAM23 gene in proliferation, migration and cell invasion, and to prove the existence of cell interaction between ADAM23 positive and negative cells. The analysis of ADAM23 gene expression in samples from different stages of gliomas by RT-PCR revealed that the expression of this gene decreases over tumor progression and is greatly reduced in tumors of advanced degree. However, unlike that observed in breast tumors, the ADAM23 gene silencing in gliomas is not caused by hypermethylation of its promoter region or by mutations in its coding region, or by loss of heterozygosity. Unfortunately, it was not possible to select clones derived from the U87MG glioblastoma cell line with stable silencing of the gene ADAM23 for the functional testing. Apparently, the silencing of ADAM23 in this cell line results in cell cycle arrest in G0/G1 phase, preventing the selection of clones with stable gene silencing. The same phenomenon was not observed in SKmel-37 melanoma cell line, allowing selection of clones with stable silencing of ADAM23 and functional testing. Monolayer proliferation curves and in vitro MTT incorporation assays in three-dimensional models showed that ADAM23 silencing in the SKmel-37 cell line reduces their rate of proliferation by 20-50%. Flow cytometry assays demonstrated that ADAM23 silencing interferes with the expression of αvß3 and αvß5 integrins in the cell membrane, resulting in a 50% decrease in binding afinity to the matrix and a significant increase in migratory and invasive abilities on collagen. In vitro and in vivo assays using ADAM23 positive and negative SKmel-37 cell mixtures also confirmed the existence of interaction between the two cell subsets. In vitro invasion and migration on collagen assays revealed that ADAM23 negative cells induce migration and invasion of positive cells. Furthermore, in in vivo tumorigenic tests we found that tumors formed from injection of a mixture of positive and negative cells exhibit growth similar to the tumors formed after injection of ADAM23 positive cells

Caracterização funcional das isoformas de splicing do gene ADAM23 / Functional characterization of ADAM23 gene splicing isoforms

A ADAM23 é uma glicoproteína transmembrana pertencente à família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) que apresenta a estrutura protéica típica dos membros desta família, mas não possui atividade de metaloprotease. O gene ADAM23 apresenta três isoformas de splicing, α, ß e γ, que codificam proteínas com porções C-terminais distintas. As isoformas α e ß codificam proteínas com domínios transmembranas diferentes, enquanto γ provavelmente consiste em uma isoforma secretada ou citoplasmática de ADAM23. Foi demonstrado que o gene ADAM23 está epigeneticamente silenciado em tumores de mama de estágios mais avançados e que seu silenciamento está associado a um maior risco de desenvolvimento de metástases e a um pior prognóstico. Recentemente, foi descrito que a proteína ADAM23 interage diretamente com a integrina αVß3 na linhagem tumoral de mama MDA-MB-435, sendo capaz de modular seu estado conformacional, controlando sua ativação. Utilizando RNAi, observou-se que o silenciamento completo do gene ADAM23 (i.e., as três isoformas) aumenta os níveis de αVß3 em conformação ativa na superfície das células MDA-MB-435, promovendo um incremento de sua capacidade migratória e adesiva. No presente trabalho, avaliamos por reações de amplificação em tempo real o perfil de expressão das três isoformas de splicing do gene ADAM23 em cinco tecidos normais (mama, cólon, cérebro, próstata e pâncreas) e em doze linhagens tumorais derivadas destes tecidos. Observamos diferenças nos níveis de expressão das isoformas em todas as amostras avaliadas, tanto dentro de uma determinada amostra, como quando comparamos tecidos normais entre si ou com linhagens tumorais. A isoforma γ é a mais expressa em todos os tecidos normais (exceto em cérebro) e em todas as linhagens tumorais. Em tecido normal de mama e de próstata e nas doze linhagens tumorais, ADAM23α é a segunda isoforma mais expressa, sendo ß a menos expressa. Constatamos também que a fração representada por cada isoforma, em relação à expressão total do gene ADAM23, está alterada nas linhagens tumorais, em comparação aos tecidos normais correspondentes. Com o intuito de elucidar a função das isoformas de ADAM23 separadamente, utilizamos shRNAs (short hairpin RNAs) para reduzir a expressão de cada isoforma de modo individual e específico na linhagem tumoral MDA-MB-435, e avaliamos seu efeito na proliferação, na morfologia, na adesão e no espraiamento celular. Verificamos que a redução da expressão da isoforma γ aumentou significativamente a taxa de proliferação das células MDA-MB-435 cultivadas em modelo tridimensional. Demonstramos também que ADAM23γ participa da regulação da morfologia e da capacidade de espraiamento das células MDA-MB-435 em condições padrão de cultivo (i.e., meio de cultura completo e placas não-sensibilizadas com substratos) e em componentes específicos da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno I e matrigel. A isoforma α também está envolvida no controle da morfologia e do espraiamento da linhagem MDA-MB-435, porém, de modo distinto da isoforma γ. Já ADAM23ß não interfere na morfologia das células MDA-MB-435 e tem efeito marginal no espraiamento celular apenas em condições padrão de cultivo. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as isoformas de ADAM23 são diferencialmente expressas em tecidos normais e tumorais, e exercem funções biológicas distintas

ADAM23 is a transmembrane glycoprotein that belongs to the ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family of proteins and exhibits the typical protein structure of the family members, but it doesn't have metalloprotease activity. The ADAM23 gene has three splicing isoforms, α, ß and γ, that code for proteins with different C-terminal regions. Isoforms α and ß code for proteins with different transmembrane domains, while γ probably constitute a secreted or cytoplasmatic isoform of ADAM23. It has been demonstrated that the ADAM23 gene is epigenetically silenced in advanced stage breast tumors and that its silencing is associated with a higher risk of developing metastases and with a worse prognosis. Recently, it was described that ADAM23 protein interacts directly with αVß3 integrin in the breast tumor cell line MDA-MB-435, modulating its conformational state and controlling its activation. Using RNAi, it was observed that the complete silencing of ADAM23 gene (the three isoforms) raises the levels of αVß3 in its active conformation in the surface of MDA-MB-435 cells, promoting an increase in its migratory and adhesive capacity. In the present work, we evaluated by real time PCR the expression pattern of the three splicing isoforms of ADAM23 gene in five normal tissues (breast, colon, brain, prostate and pancreas) and in twelve tumor cell lines derived from these tissues. We observed differences in the expression levels of the three isoforms in all samples, either within a specific sample or comparing normal tissues among them or with tumor cell lines. Isoform γ has the highest expression in all normal tissues (except for brain) and in all tumor cell lines evaluated. In breast and prostate normal tissues and in all tumor cell lines, ADAM23α is the second most expressed isoform, while ß is the less expressed. We also noticed that the ratio represented by each isoform, relative to the total expression of ADAM23 gene, is altered in the tumor cell lines, compared to the corresponding normal tissues. With the aim to elucidate the function of ADAM23 isoforms separately, we used shRNAs (short hairpin RNAs) to reduce the expression of each isoform specifically in the MDA-MB-435 tumor cell line, and studied its effects in proliferation, morphology, adhesion and cell spreading. We observed that the reduced expression of isoform γ significantly increased the proliferation rate of MDA-MB-435 cells cultivated in tridimensional system. Also, we demonstrated that ADAM23γ participates in the regulation of cell morphology and spreading of MDA-MB-435 cells, both in standard culture conditions (cell culture media with fetal serum and in plates not sensitized with substrates) and in specific components of extracellular matrix, such as fibronectin, collagen type I and matrigel. Isoform α is also involved in the control of morphology and spreading of MDA-MB-435 cell line, although in a distinct manner from isoform γ. ADAM23ß doesn't interfere in the morphology of MDA-MB-435 cells and plays a discrete role in cell spreading only under standard culture conditions. Together, our results demonstrate that ADAM23 isoforms are differently expressed in normal and tumoral tissue, and play distinct biological roles