Mitochondrial DNA Analysis of a Sample of Pre-Columbian Acient Remains from Norte de Santander, Colombia (Chitarera Cultural Area) / Análisis de adn mitocondrial en una muestra de restos óseos precolombinos de norte de santander, colombia (área cultural chitarera)

RESUMEN Los análisis de ADN antiguo (ADNa) han incrementado en los últimos años permitiendo conocer la diversidad genética de las poblaciones precolombinas. En Colombia, existen pocos registros arqueológicos de la población prehispánica del Norte de Santander habitada en el siglo XVI por el grupo Chitarero. Por este motivo, nos propusimos analizar la diversidad genética a partir de secuencias de la región HVRI del ADNmt y determinar sus posibles relaciones con otras comunidades tanto antiguas como contemporáneas. Se analizaron siete individuos precolombinos asociados a este grupo prehispánico, recuperados en los municipios de Cácota y Silos en el departamento de Norte de Santander de los Andes Orientales colombianos, siguiendo criterios estrictos de autenticidad para el ADNa. En todos los individuos se logró identificar el haplogrupo B caracterizado por el polimorfismo en la posición 16217C, siendo éste uno de los más frecuentes en comunidades precolombinas y contemporáneas de los Andes Suramericanos. Este hallazgo indica que este grupo poblacional se encuentra estrechamente emparentado por línea materna, con posibles índices de endogamia, con una probable densidad demográfica baja y una baja diversidad genética, similares a lo observado en comunidades pertenecientes a periodos anteriores como el Formativo. Este grupo precolombino exhibe una de las diversidades genéticas más bajas reportadas en las poblaciones pertenecientes a la familia lingüistica Chibcha. Estos resultados genéticos coinciden con los planteamientos sobre el grupo Chitarero de pertenecer a comunidades pequeñas independientes, con asentamientos dispersos, apartados unos de otros.

ABSTRACT In the last few years there has been an increase in ancient DNA (aDNA) analyses that has allowed shedding light on the diversity of pre-Columbian populations. In Colombia, there are few archaeological records belonging to the prehispanic population from Norte de Santander inhabited in the XVI century by the Chitarero. For this reason, we performed a genetic diversity analysis of the HVRI region of mtDNA in order to determine their possible relationships with other communities both ancient and contemporary. We analyzed seven pre-Columbian individuals belonging to this pre-Hispanic group, recovered from the municipalities of Cácota and Silos in the department of Norte de Santander located at the Colombian Andes, following strict authenticity criteria for aDNA. All individuals were identified as belonging to haplogroup B, characterized by the polymorphism found at position 16217C which is one of the most frequent haplogroups in pre-Columbian and contemporary communities of the South American Andes. This finding suggests that this population group was closely related through its maternal lineage, with possible inbreeding indexes, low population density and therefore low genetic diversity, similar to what is observed in communities belonging to previous periods such as the Formative period. This pre-Columbian group exhibits one of the lowest genetic diversities reported in populations belonging to the Chibcha linguistic family. These genetic results coincide with the views on the Chitarero group as belonging to small independent communities, with dispersed settlements separated among them.

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y DISTRIBUCIÓN POTENCIAL DEL ANFÍPODO TERRESTRE Talitroides topitotum (Crustacea: Amphipoda: Talitridae) EN COSTA RICA / Molecular Identification and Potential Distribution of Terrestrial Amphipod Talitroides topitotum (Crustacea: Amphipoda: Talitridae) in Costa Rica

RESUMEN El anfípodo terrestre, Talitroides topitotum, es un talítrido distribuido mundialmente en regiones subtropicales y templadas, con un amplio rango de distribución altitudinal, temperatura y humedad. Se colectaron y procesaron especímenes desde el año 2012 al 2016, mediante remoción-filtración de sustratos húmedos. Se identificaron taxonómicamente por características fenotípicas diagnósticas, se determinó su estado de desarrollo y se separaron por sexo. Se extrajo ADN de anfípodos completos, seguido de una PCR de los genes citocromo oxidasa subunidad 1 y del ARN ribosomal de la subunidad 16S. Se obtuvo un árbol filogenético por máxima verosimilitud con un modelo GTR-GAMMA. El análisis de la distribución potencial de T. topitotum se estimó utilizando 19 variables bioclimáticas. En este estudio, se amplía la distribución previamente reportada y en altitudes entre los 1900 a 595 m s.n.m. Se analizaron 39 localidades, en las cuales: 1) Hay presencia de T. topitotum, 2) no hubo presencia de anfípodos terrestres, 3) no hubo presencia de Talitroides sp., pero sí de un anfípodo nativo. La abundancia proporcional de T. topitotum se inclina hacia las hembras adultas, una proporción alta de juveniles y no se detectaron individuos machos. El análisis bioinformático determinó el posicionamiento taxonómico de la especie T. topitotum dentro del agrupamiento de anfípodos terrestres, además, la especie exógena diverge de Cerrorchestia hyloraina demostrando una separación filogenética entre especies, las cuales pueden estar compartiendo hábitats. T. topitotum, según el modelo de máxima entropía, posee una alta capacidad de dispersión y estaría siendo favorecida, en cuanto a su asentamiento y propagación, por elementos climáticos como temperatura, precipitación y humedad, y factores como la altitud. Nuestros hallazgos son relevantes para la toma de decisiones de manejo y monitoreo del desplazamiento de especies nativas de anfípodos terrestres en la región.

ABSTRACT The land-hopper, Talitroides topitotum, is a talitrid amphipod distributed worldwide in subtropical and template regions, with a wide range of altitudinal distribution, temperature and humidity. Specimens were collected and processed since 2012 until 2016, by collection-filtration of wet substrates. Specimens were taxonomically identified using diagnostic phenotypic characteristics, and the developmental stage and sex were recorded. DNA was extracted from whole amphipods, followed by PCR of cytochrome oxidase subunit 1 and ribosomal RNA subunit 16S genes. Partial genetic sequences were obtained and a maximum-likelihood phylogenetic tree was calculated based on a GTR-GAMMA model. The analysis of potential distribution of T. topitotum was estimated using 19 bioclimatic variables. This study extends the previously reported distribution and elevations between 1900 and 595 m a.s.l. Thirty-nine localities were analyzed, where the following categories were registered: 1) T. topitotum is present, 2) terrestrial amphipods are not present, 3) T. topitotum is not present, but the native amphipod is present. The relative abundance of T. topitotum corresponds to adult females, a high proportion ofjuveniles and no males were collected. The bioinformatic analysis established the taxonomic position of T. topitotum within a group of terrestrial amphipods; moreover, the invasive species diverges of Cerrorchestia hyloraina, demonstrating the phylogenetic separation between these species that could be sharing habitats. Based on the model of maximum entropy, T. topitotum shows a high dispersion capacity and its establishment and propagation are been improved by climatic elements such as temperature, precipitation, humidity, and elevation. Our findings are relevant for management policies and monitoring the distribution of native species of terrestrial amphipods in the region.

IMPLEMENTACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE ANÁLISIS DE ADN MITOCONDRIAL EN Rhinoclemmys nasuta (TESTUDINES:GEOEMYDIDAE) / Implementation of DNA Mitochondrial Analysis in Rhinoclemmys nasuta (Testudines: Geoemydidae)

Rhinoclemmys nasuta (Testudines: Geoemydidae) es considerada una especie casi endémica de Colombia y la más primitiva del género, sin embargo, se encuentra clasificada por la IUCN como deficiente de datos, ya que la información disponible no es suficiente para hacer una evaluación directa o indirecta de su riesgo de extinción. En este trabajo se describe la implementación del método para realizar la secuenciación de la región control del ADN mitocondrial de R. nasuta, con el propósito de generar herramientas técnicas para futuros estudios de evolutivos y de conservación. Se utilizó el método de desalamiento (Salting-out) para extraer ADN a muestras sanguíneas procedentes de Isla Palma y Playa Chucheros (Bahía Málaga-Pacífico Colombiano) y se utilizó una pareja de cebadores degenerados (reportada para Chrysemys picta Testudines: Emydidae) para realizar la amplificación. Se obtuvieron fragmentos de 800pb siendo exitosa la reacción de secuenciación de los amplificados, y se estableció un porcentaje de homología mayor al 92 % entre las secuencias obtenidas y las secuencias de ADNmt de Sacalia quadriocellata (Testudines:Geoemydidae) y Cuora aurocapitata (Testudines:Geoemydidae), depositadas en el GeneBank. Este resultado demuestra que el método descrito puede ser una herramienta útil para el estudio de las poblaciones de R. nasuta del Pacífico colombiano, lográndose una efectiva secuenciación de la región control del ADNmt de esta especie.

Rhinoclemmys nasuta (Testudines:Geoemydidae) is considered an almost endemic specie to Colombia and the most primitive species of Rhynoclemmys. However, it is classified data deficient by IUCN because the available information is not enough to make a direct or indirect assessment of its extinction risk. Here, we describe the implementation of the method to analyze the mitochondrial DNA control sequence (mtDNA) of R. nasuta in order to generate tools for future studies in systematics and population conservation. Genomic mtDNA was extracted by salting-out from blood samples from Isla Palma and Playa Chucheros (Bahía Málaga-Colombian Pacific Coast) and we used a pair of degenerate primers (reported for Chrysemys picta, Testudines:Emydidae) to perform amplification. Fragments of 800pb were obtained and the sequencing reaction was effective. A homology percentage above of 92 % was established between the obtained sequences and mtDNA sequences from Sacalia quadriocellata (Testudines:Geoemydidae) ,and Cuora aurocapitata (Testudines:Geoemydidae) reported in the GenBank. This result shows that the described method can be a useful tool for the study of R. nasuta populations in the Colombian Pacific region, achieving an effective sequencing of the mtDNA control region of this species.

Filogeografía de Holothuria (Halodeima) inornata Semper, 1868 (Echinodermata: Holothuroidea)

Se evaluó la estructura genética de las poblaciones de Holothuria (Halodeima) inornata Semper, 1868, y se investigó cuáles podrían ser las barreras para el flujo de genes y procesos históricos. Se recolectaron muestras tratando de abarcar su ámbito de distribución, desde México hasta el norte de Perú. Con base en secuencias del gen COI se detectaron 118 haplotipos en 220 individuos y las diferencias entre dichos haplotipos fueron debidas a 97 sitios variables (21.41%) en los 453 pb secuenciados. Se observó una alta diversidad de haplotipos (h=0.979) y moderada diversidad nucleotídica (π=0.017). Para analizar la diferenciación genética, se utilizaron los valores de Fst, el test exacto de diferenciación poblacional y los análisis de varianza molecular (AMOVA). Estos análisis sugieren que existen dos poblaciones: las del norte, frente a las costas de: Sinaloa, Jalisco, Michoacán, Guerrero y Oaxaca; y las del sur, frente a las costas de: Chiapas, El Salvador, Panamá y Perú. Los acontecimientos históricos y los patrones oceanográficos podrían ser los principales factores que determinaron la dispersión y estructura de la población de H. inornata, es probable que la población original se haya extendido inicialmente en el sur y luego hacia el norte. Además, la separación entre estas dos poblaciones podría deberse al Golfo de Tehuantepec, el cual está constituido por una serie de eventos tectónicos y oceanográficos que constituyen una barrera para el asentamiento de H. inornata.

Genetic structure of the populations of H. inornata was evaluated and the barriers for genetic flux and historic processes were investigated. Samples were collected trying to cover the distribution range of the species, from Mexico to northern Perú. Based on COI sequences, 118 haplotypes from 220 specimens were detected; the differences between such haplotypes were due to 97 variable sites (21.41%) of the 453 bp sequenced. A high haplotype diversity (h=0.979) and a moderate nucleotidic diversity were observed. The values of Fst, the exact test of population differentiation, and the molecular variance analysis (AMOVA) were used in order to analyze the genetic differentiation. These analyses suggest the existence of two populations: northern, off the coasts of Sinaloa, Jalisco, Michoacán, Guerrero, and Oaxaca, and southern, off the coasts of Chiapas, El Salvador, Panamá and Perú. Historic events and oceanographic patterns may be the main factors determining dispersion and structure of Hi populations. It seems probable that the original population have extended first in the south and then northern. Besides, the split between these two populations may be due to several tectonic and oceanographic events constituting a barrier for H. inornata settling.

Uso de la técnica SSCP para detectar mutaciones puntuales del ADN mitocondrial humano

En el presente trabajo se evalúa la técnica de SSCP (polimorfismo de conformación de cadena individual de ADN) para detectar mutaciones puntuales, tanto por su sensibilidad en la detección (alrededor 80% en condiciones ideales), como por su implementación fácil y económica. Se utilizaron como controles positivos y negativos, ADN de voluntarios caracterizados previamente para las mutaciones puntuales de 5 RFLPs mitocondriales. Para la optimización de la prueba fueron ensayadas concentraciones variables del tampón TBE (1X y 0,5X) y del glicerol (10%, 5% y 0) en geles de poliacrilamida. Cuatro de los 5 RFLPs fueron detectados en las condiciones utilizadas y pueden ser usados en estudios de rutina sin usar enzimas de restricción. Además, la técnica SSCP permitió determinar mutaciones desconocidas en un segmento de 394 nucleótidos de la región hipervariable (HVI) del ADNmt. Diferencias en correspondencia a los distintos haplotipos fueron detectados e incluso permitió discernir grupos dentro del mismo subtipo. La secuenciación de dos muestras del subtipo B1 con migración diferencial en SSCP, corroboró la existencia de siete nucleótidos distintos.

We evaluate the use of SSCP (single strand conformational polymorphism), a relatively easy and inexpensive technique for the detection of point mutations with a sensibility around 80% under ideal conditions. To test the technique, we used samples of volunteers whose DNA had been previously characterized for the presence or absence of 5 mitochondrial RFLPs. Optimization of the tests included variations in TBE (1X and 0,5X) and of glycerol concentration (10%, 5% and no glycerol) in polyacrylamide gels. Four out of five RFLPs were detected under the conditions used and could be applied routinely without using restriction enzymes. In addition, the SSCP technique allowed detection of unknown mutations in a 394 bp nucleotide segment of the hypervariable (HVI) region of mtDNA. Differences corresponding to different haplotypes were detected, helping to distinguish groups within the same subtype. Sequencing of two samples of subtype B1 with differential migration on SSCP gels, proved the existence in seven different nucleotides.