Expresión y purificación de las proteínas estructurales del rotavirus VP5* y VP8* en bacterias E. coli BL21(DE3) / Expression and purification of rotavirus structural proteins VP5* and VP8* in bacteria E. coli BL21(DE3)

La caracterización de las proteínas estructurales del rotavirus y de las proteínas de la superficie de la célula hospedera implicadas en la unión y penetración del virion requiere de la disponibilidad de cantidades suficientes y de alto grado de pureza de estas proteínas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue expresar y purificar las proteínas estructurales del rotavirus de la cepa RRV, VP5* y VP8*, y producir anticuerpos policlonales dirigidos contra ellas. Se expresaron las proteínas recombinantes VP5* (rVP5*) y VP8* (rVP8*) en bacterias E. coli BL21(DE3) transfectadas con el plásmido pGEX-4T que contenía sus secuencias codificantes. Se consideraron como variables el medio de crecimiento, número de bacterias antes de inducir la expresión, concentración del inductor y tiempo de inducción. La mayor proporción de rVP8* se obtuvo cuando las bacterias transformadas se cultivaron en medio LB y la inducción se llevó a cabo con 1 mM de IPTG cuando el cultivo alcanzó una OD 600 nm de 0.5 y la inducción se mantuvo durante 6 h. rVP5* alcanzó la mayor proporción cuando células a una OD 600 nm de 0.2 fueron inducidas con 0.5 mM de IPTG durante 4 h en medio 2XYT en presencia de glucosa al 2 %. Las proteínas recombinantes obtenidas, acumuladas en la fracción insoluble, fueron solubilizadas con detergentes iónicos y no iónicos, seguido de purificación mediante cromatografía de afinidad antes de ser empleadas como antígenos para la producción de anticuerpos policlonales en conejos. Estos anticuerpos se caracterizaron mediante su capacidad de reconocimiento de los antígenos correspondientes en ELISA, "Western blotting", y en ensayos de inmunocitoquímica en células infectadas con rotavirus RRV. La cantidad y el grado de pureza de las proteínas recombinantes obtenidas, y los anticuerpos dirigidos contra ellas, anticipan su utilidad como herramientas en la caracterización de la interacción virus-célula.

The characterization of rotavirus structural proteins and the cell surface proteins involved in virion binding and penetration depends on the availability of substantial amounts of highly purified proteins. The aim of the present work was to express and purify the rotavirus structural proteins VP5* and VP8* in order to produce polyclonal antibodies against them. Recombinant proteins VP5* (rVP5*) and VP8* (rVP8*) were expressed in E. coli cells transfected with pGEX-4T or pET 28a containing their corresponding encoding sequences. Culture medium, bacterial concentration before induction, inductor concentration and induction time were used as variables. The greater proportion of rVP8* was obtained when transfected bacteria were grown in medium LB and induction was started by adding 1 mM IPTG to cells at OD 600 nm 0.5 followed by 6 h-induction. The highest proportion of rVP5* was reached when cells at OD 600 nm 0.2 were induced with 0.5 mM IPTG for 4 h in medium 2XYT containing 2% glucose. The recombinant proteins accumulated in the insoluble fraction were solubilized with ionic and non-ionic detergents, and purified by affinity chromatography before being used as antigens for production of rabbit polyclonal antibodies. The antibodies produced were characterized through their ability to recognize the corresponding antigens in ELISA, Western blotting, and immunochemistry assays in rotavirus infected cells. The amount and purity of recombinant proteins obtained in this work, and the antibodies against them, are expected to be useful for the characterization of the virus-cell interaction.

Cloning,expression and purification of fragile X mental retardation protein / 基础医学与临床

Objective Explore the conditions of the cloning,expression and purification of FMRP.Methods The plasmid pET22b(+)-FMR1,constructed by molecular cloning,was transformed into E.coli BL21(DE3) competent cells and induced to express FMRP by IPTG.Recombinant FMRP was purified by affinity chromatography,verified by Western-blot,and tested for its RNA binding ability.Results FMR1 cDNA was successfully cloned into pET22b(+) vector and expressed in E.coli BL21(DE3).A protein with Mr 79 000 was purified and confirmed to be FMRP.This protein retained the RNA binding ability of FMRP.Conclusion We successfully expressed recombinant hFMRP with high purity and activity in E.coli,which provided a reliable material to study the function of FMRP.