ABSTRACT
Abstract Background: Bovine leukemia virus (BLV) is the causative agent of enzootic bovine leukosis (EBL). This disease mainly affects cattle, causing severe economic losses to producers. Objective: To establish individual and herd seroprevalence and determine the risk factors associated with BLV seropositivity for dairy and dual-purpose cattle herds in Ecuador. Methods: A total of 2,668 serum samples from 386 herds were collected. A questionnaire, including variables related to cattle health, management and the environment was completed by each herd. A commercial blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test was used to determine seropositivity. A generalized estimating equation model (GEE) was developed to determine the factors associated with BLV seropositivity. Results: Individual seroprevalence of BLV infection in Ecuador was 17.3% (CI95% = 15.86-18.74%). Herd prevalence was 37.8% (CI95% = 33.0-42.6%), and intra-herd prevalence ranged between 12.5 and 100% (median: 37.5%). The risk factors associated with BLV seropositivity were artificial insemination (OR: 2,215; CI95% =1.402-3.501), concrete floors (OR: 2.178; CI95% = 1.217-3.889), presence of wild ruminants (OR: 2.998; CI95% = 1.788-5.027), and sampling season (wet; OR: 1.996; CI95% = 1.140-3.497). Conclusions: Results indicate that BLV is widespread in cattle herds in Ecuador. In addition, the study suggests that a control program to fight BLV infection should focus on controlling the risk factors identified.
Resumen Antecedentes: El virus de la leucosis bovina (BLV) es el principal agente etiológico causante de la leucosis enzoótica bovina (EBL). Esta enfermedad afecta a los bovinos causando grandes pérdidas económicas a los productores. Objetivo: Establecer la seroprevalencia y dispersión del BLV, así como los factores de riesgo asociados a la seropositividad en explotaciones lecheras y de doble propósito en Ecuador. Métodos: Se recolectó un total de 2.668 muestras de suero de 386 explotaciones. Se aplicó un cuestionario que incluyó variables relacionadas con la salud del hato, medidas de manejo, y características ambientales de cada explotación. Para los análisis serológicos se utilizó un test inmunológico ligado a enzimas (ELISA). Para definir los factores de riesgo asociados a la seropositividad a BLV se desarrolló un modelo utilizando ecuaciones de estimación generalizadas (GEE). Resultados: La seroprevalencia de BLV en Ecuador fue de 17,3% (IC95% = 15,86-18,74%). La dispersión fue de 37,8% (IC95%= 33,0-42,6%), y la prevalencia intra-hato alcanzó rangos entre 12,5-100% (media: 37,5%). Los factores de riesgo asociados a la seropositividad a BLV fueron: inseminación artificial (OR: 2,215; IC95% = 1,402-3,501), piso de concreto (OR: 2,178; IC95% = 1,217-3,889), presencia de rumiantes salvajes (OR: 2,998; IC95% = 1,788-5,027), y temporada de muestreo (húmeda; OR: 1,996; IC95% = 1,140-3,497). Conclusiones: Los resultados indican que el BLV se encuentra disperso en las explotaciones de Ecuador. Adicionalmente, se sugiere la implementación de un programa de control para la lucha contra el BLV, debiéndose considerar medidas que se enfoquen al control de los factores de riesgo identificados en esta investigación.
Resumo Antecedentes: O vírus da leucemia bovina (BLV) é o principal agente causador da leucose enzoótica bovina (EBL). Esta doença afeta o gado causando graves prejuízos econômicos aos produtores. Objetivo: Estabelecer a soroprevalência e dispersão do BLV, assim como os fatores de risco associados à soropositividade nas produções leiteiras e de duplo propósito no Equador. Métodos: Um total de 2.668 amostras de soro de 386 explorações foram coletadas. Foi aplicado um questionário que incluía variáveis relacionadas à saúde do rebanho, medidas de manejo e ambiente para cada exploração. Para a análise sorológica foi utilizado um teste imunológico sobre enzimas (ELISA) para determinação da soropositividade. Para definir os fatores de risco associados à soropositividade a BLV, foi utilizado um modelo de equações estimativas generalizadas (GEE). Resultados: A soroprevalência de BLVno Equador é de 17,3% (IC95% = 15,86-18,74%). La dispersão de 37,8% (IC95% = 33,0-42,6%), e a prevalência intra-rebanho alcançou entre 12,5-100% (media: 37,5%). Os fatores de risco associados à soropositividade a BLV foram inseminação artificial (OR: 2,215; IC95% = 1,402-3,501), chão de concreto (OR: 2,178; IC95% = 1,217-3,889), presença de ruminantes selvagens (OR: 2,998; IC95% = 1,788-5,027) e época da amostragem (úmida; OR: 1,996; IC95% = 1,140-3,497). Conclusões: Os resultados indicam que o BLV se encontra disseminado nas explorações no Equador. Adicionalmente, o estudo pode contribuir para a implementação de um programa de controle para a luta contra o BLV, devendo-se considerar ações de controle dos fatores de risco identificados nesta investigação.
ABSTRACT
Abstract Bovine leukemia virus (BLV) is an important cattle pathogen that causes major economic losses worldwide, especially in dairy farms. The use of animal models provides valuable insight into the pathogenesis of viral infections. Experimental infections of sheep have been conducted using blood from BLV-infected cattle, infectious BLV molecular clones or tumor-derived cells. The Fetal Lamb Kidney cell line, persistently infected with BLV (FLK-BLV), is one of the most commonly used long-term culture available for the permanent production of virus. FLK-BLV cells or the viral particles obtained from the cell-free culture supernatant could be used as a source of provirus or virus to experimentally infect sheep. In this report, we aimed to determine the minimum amount of FLK-BLV cells or cell-free supernatant containing BLV needed to produce infection in sheep. We also evaluated the amount of antibodies obtained from a naturally-infected cow required to neutralize this infection. We observed that both sheep experimentally inoculated with 5000 FLK-BLV cells became infected, as well as one of the sheep receiving 500 FLK-BLV cells. None of the animals inoculated with 50 FLK-BLV cells showed evidence of infection. The cell-free FLK-BLV supernatant proved to be infective in sheep up to a 1:1000 dilution. Specific BLV antibodies showed neutralizing activity as none of the sheep became infected. Conversely, the animals receiving a BLV-negative serum showed signs of BLV infection. These results contribute to the optimization of a sheep bioassay which could be useful to further characterize BLV infection.
Resumen El virus de la leucosis bovina (bovine leukemia virus [BLV]) es un importante agente patógeno del ganado que causa importantes pérdidas económicas en todo el mundo, especialmente en los rodeos lecheros. El uso de modelos animales proporciona información valiosa sobre la patogénesis de las infecciones virales. Se realizaron infecciones experimentales en ovejas usando sangre de bovinos infectados con BLV, clones moleculares de BLV infecciosos o células derivadas de tumores. La línea celular Fetal Lamb Kidney, persistentemente infectada con el BLV (FLK-BLV), es uno de los cultivos a largo plazo más utilizados para la producción permanente de virus. Las células FLK-BLV o las partículas virales obtenidas del sobrenadante del cultivo libre de células podrían usarse como fuente de provirus o de virus para infectar experimentalmente ovejas. En este trabajo, nuestro objetivo fue determinar la cantidad mínima de células FLK-BLV o de sobrenadante libre de células que contiene BLV necesaria para producir infección en ovejas. También evaluamos la cantidad de anticuerpos bovinos anti-BLV necesaria para neutralizar la infección. Observamos que las dos ovejas inoculadas experimentalmente con 5000 células FLK-BLV se infectaron, y que una de las dos ovejas que recibieron 500 células FLK-BLV se infectó. Ninguno de los animales inoculados con 50 células FLK-BLV mostró evidencia de infección. El sobrenadante FLK-BLV libre de células demostró ser infectivo en ovejas hasta la dilución 1:1000. Los anticuerpos BLV específicos mostraron actividad neutralizante, ya que ninguna de las ovejas se infectó. Por el contrario, los animales que recibieron un suero BLV negativo mostraron signos de infección por BLV. Estos resultados contribuyen a la optimización de un bioensayo en ovejas útil para caracterizar la infección por BLV.
Subject(s)
Animals , Biological Assay/veterinary , Sheep/immunology , Enzootic Bovine Leukosis/prevention & control , Leukemia Virus, Bovine/pathogenicity , Deltaretrovirus Infections/immunology , Models, AnimalABSTRACT
SUMMARY Bovine leukemia virus (BLV) is an immunosuppressant retrovirus that primarily affects dairy livestock, its target cells are B lymphocytes in which it integrates its genome infecting cattle for life. It is important to identify the distribution of the BLV in the region and to reconstruct its evolutionary history through phylogenetic trees, for the province of Antioquia this is the first report of the BLV genotypes. The aim of this study was to identify the genotype of BLV circulating in dairy cattle of different regions of the province of Antioquia, Colombia. DNA was extracted from 8 Holstein cows. Nested PCR was performed to amplify a fragment of 444 pb of the env gene. The env viral gene codes for surface protein gp51, gene is highly conserved and it is used for phylogenetic analysis. Obtained amplicons were sequenced, manually aligned in MEGA V7 program, and compared to 53 viral env gene sequences registered in GenBank. Phylogenetic analysis was performed by Maximum Likelihood and Bayesian methods. Two circulating genotypes were found: the most common genotype was 1, found in seven samples; they grouped with sequences from EE. UU, Argentina and Japan; only one sample was classified as genotype 3 and was grouped with samples from EE. UU and Japan. At least two genotypes (1 and 3) of BLV are circulating in Antioquia; however, more cattle and herds should be evaluated to elucidate the diversity and distribution of BLV in Colombia.
RESUMEN El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus inmuno-supresor que afecta, principalmente, al ganado lechero; sus células diana son los linfocitos B, en los cuales, integra su genoma, infectando al ganado de por vida. Es importante identificar la distribución del BLV en la región y reconstruir su historia evolutiva, a través de árboles filogenéticos; para el departamento de Antioquia, este es el primer reporte de los genotipos del BLV. El objetivo de este estudio fue identificar el genotipo de BLV que circula en ganado lechero de diferentes regiones del departamento de Antioquia, Colombia. Se extrajo ADN de 8 vacas Holstein. Se realizó una PCR anidada, para amplificar un fragmento del gen env de 444 pb. El gen env viral codifica la proteína de superficie gp51, altamente conservado y es usado en análisis filogenéticos. Los amplicones obtenidos se secuenciaron, se alinearon manualmente en el programa MEGA V7 y se compararon con 53 secuencias del gen env viral, registradas en GenBank. El análisis filogenético, se realizó por métodos de Máxima Verosimilitud y Bayesianos. Se encontraron dos genotipos circulantes: el genotipo más común fue 1, hallado en siete muestras, agrupadas con secuencias de EE. UU, Argentina y Japón; solo una muestra se clasificó como genotipo 3 y se agrupó con muestras de EE. UU y Japón. Al menos dos genotipos (1 y 3) de BLV están circulando en Antioquia; sin embargo, se deben evaluar más bovinos y hatos para elucidar la diversidad y la distribución de BLV en Colombia.
ABSTRACT
Bovine leukemia virus (BLV) is associated with the most common neoplastic disease of cattle. BLV has a silent dissemination in the herd due to infected cell exchange, thus the concentration of BLV-infected cells in blood should play a major role in the success of viral transmission. Genes from Bovine leukocyte antigen (BoLA), the MHC system of cattle, are associated with genetic resistance and susceptibility to a wide range of diseases, and also with production traits. Some BoLA DRB3.2 allele polymorphisms in Holstein cattle have been associated with resistance or susceptibility to BLV-disease development, or with proviral load (PVL). This investigation studied 107 BLV-infected Argentinean Holstein dairy cows, all of them belonging to one herd. PVL was analysed by qPCR and animals were classified as high proviral load (HPVL, N = 88) and low proviral load (LPVL, N = 19), and BoLA DRB3.2 alleles were genotyped. Alleles BoLA DRB3.2*1501 and *1201 were significantly associated with HPVL (p = 0.0230 and p = 0.0111 respectively), while allele BoLA DRB3.2*0201 was significantly associated with LPVL (p = 0.0030). The present study aims at contributing to the knowledge of the association between BoLA polymorphism and development of a BLV infection profile. Genes that best explain the PVL in this population resulted BoLA DRB3.2*0201 (as a protection factor) and *1501 (as a risk factor). Allelic differences may play an important role in the development of effective immune responses. A better understanding of how BoLA polymorphism contributes to these responses and the establishment of a BLV status is desirable to schedule and evaluate control measures.(AU)
O vírus da leucemia bovina (BLV) está associado à doença neoplásica mais comum do gado bovino. O BLV tem uma disseminação silenciosa no rebanho devido à troca de células infectadas, assim, a concentração de células BLV infectadas no sangue deve desempenhar um papel importante no sucesso da transmissão viral. Os genes do antígeno leucocitário bovino (BoLA), sistema MHC do gado bovino, estão associados à resistência genética e à susceptibilidade a uma ampla gama de doenças, bem como às características da produção. Alguns polimorfismos de alelos de BoLA DRB3.2 em bovinos Holstein têm sido associados à resistência ou susceptibilidade ao desenvolvimento da doença BLV, ou com carga proviral (PVL). Esta investigação avaliou 107 vacas leiteiras da raça Holstein argentina infectadas com BLV e pertencentes a um único rebanho. A PVL foi analisada por qPCR, os animais foram classificados em alta carga proviral (HPVL, N = 88) e baixa carga proviral (LPVL, N = 19), e os alelos BoLA DRB3.2 foram genotipados. Os alelos BoLA DRB3.2*1501 e *1201 estavam significativamente relacionados à HPVL (p = 0,0230 e p = 0,0111, respectivamente), enquanto o alelo BoLA DRB3.2*0201, à LPVL (p = 0,0030). O objetivo deste estudo é contribuir para o conhecimento da associação entre o polimorfismo de BoLA e o desenvolvimento de infecção por BLV. Os genes que melhor explicam a PVL na população analisada resultaram em BoLA DRB3.2*0201 (como fator de proteção) e *1501 (como fator de risco). As diferenças alélicas podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de respostas imunitárias eficazes. Uma melhor compreensão de como o polimorfismo BoLA contribui para estas respostas e o estabelecimento de um estado BLV é desejável para agendar e avaliar as medidas de controle.(AU)
Subject(s)
Animals , Cattle , Antigens , Leukemia Virus, Bovine/genetics , Polymorphism, Genetic , Viral Load/veterinaryABSTRACT
O objetivo deste trabalho foi realizar a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real com o sistema Plexor® (qPCR) para o diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), por meio da comparação com testes de diagnóstico recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). A qPCR foi comparada com duas outras técnicas: a PCR nested (nPCR) e a imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Das 82 amostras analisadas pela qPCR e nPCR, 79 apresentaram resultados concordantes, sendo a concordância, classificada pelo Índice Kappa, como alta. Entre as PCRs e a IDGA, o número de resultados concordantes foi de 71 e 69, respectivamente, para qPCR e nPCR, sendo a concordância classificada como considerável. A qPCR apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade. Os valores preditivos da qPCR observados demonstraram a alta capacidade de classificação dos casos positivos e negativos. A qPCR não foi capaz de detectar três amostras positivas e tem custo ligeiramente superior que a nPCR. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais rápida, menos susceptível a contaminações, tem alta sensibilidade, não utiliza e não gera resíduos carcinogênicos. Concluímos que a qPCR pode substituir a nPCR recomendada pela OIE no diagnóstico de rotina em áreas em que a LEB é endêmica, como no Brasil.
The goal of this research was to validate a Plexor® real time Polymerase Chain Reaction (qPCR) for Enzootic Bovine Leukosis (EBL) diagnosis by comparison with methods recommend by the World Animal Health Organization (OIE). The qPCR was compared with two other techniques: the nested PCR (nPCR) and to the agar gel immunodiffusion (AGID). Of 82 qPCR and nPCR analysed samples, 79 presented concordant results, being the concordance classified by Kappa Index as high. Between the PCRs and AGID, the number of concordant results was 71 and 69, out of 82, to qPCR and nPCR, respectively, being the concordance classified as considerable, in both cases. The qPCR presented high specificity and sensitivity values. The observed qPCR negative and positive predictive values show that the qPCR has a high capacity to correctly classify positive and negative results. The qPCR was not able to detect three positive animals and has a lightly higher cost than the nPCR. However, the qPCR its faster, less prone to contamination, has a high sensitivity and does not use or generate carcinogenic residues. We conclude that the qPCR may be used to replace the OIE nPCR technique in routine diagnosis in areas where EBL is endemic, as is the case of Brazil.