Mecanismos moleculares da interação entre betalaínas cumarínicas fluorescentes e células de glioma humano / Molecular mechanisms of interaction between fluorescent coumarinic betalains and human glioma cells

Moléculas orgânicas fluorescentes são uma importante ferramenta para biologia celular. Compostos ideais para esta aplicação devem ter alto brilho (produto do coeficiente de atenuação molar e do rendimento quântico de fluorescência), ser fotoestáveis e internalizáveis, não comprometer a viabilidade celular e interagir com biomoléculas com algum grau de especificidade. Nesta Tese de Doutorado é apresentado o estudo do uso de cBeet120, uma betalaína cumarínica artificial, e células de glioma humano da linhagem U87-MG. Betalaínas são pigmentos de plantas que apresentam alta biocompatibilidade que servem como material de partida para o desenvolvimento de derivados funcionais. A sonda se acumula principalmente no núcleo das células U87- MG e marca principalmente nucléolos via interação com proteínas. A presença de DNAse ou RNAase elimina a marcação nuclear, sem afetar a fraca marcação citoplasmática de fundo. Estudos de inibição de transporte sugerem que cBeet120 é internalizada por transportadores de L-glutamato da família de transportadores de amino ácidos excitatórios (EAAT). O uso de artemisinina para inibição Ca2+-ATPases aumenta a velocidade de internalização de cBeet120 em células U87-MG. Quando irradiada com luz de cor ciano, cBeet120 no interior do núcleo de células vivas é fotoativada, resultando em um aumento da intensidade de fluorescência com o tempo (monitorado por 90 min) e o deslocamento hipsocrômico do máximo de emissão. Em células fixadas com paraformaldeído, o padrão de marcação da célula se torna mais difuso e a sonda emite fluorescência sem fotoativação. Medidas de tempo de vida de fluorescência em solução e imageamento por microscopia de tempo de vida de fluorescência permitem inferir a ocorrência da formação de um complexo proteína-cBeet120 ou um produto de transiminação que pode estar sujeito a isomerização cis/trans

Fluorescent organic molecules are an important tool for cell biology. Ideal compounds for this application must have high brightness (product of the molar attenuation coefficient and fluorescence quantum yield), be photostable and internalizable by cells, do not compromise cellular viability and interact with biomolecules with some degree of specificity. In this Doctorate Thesis, we describe the interaction of cBeet120, an artificial coumarinic betalain, and human glioma cells of line U87-MG. Betalains are plant pigments that exhibit high biocompatibility that serve as starting material for the development of functional derivatives. The probe accumulates mainly in the nucleus of the U87-MG cells and mainly marks nucleoli via interaction with proteins. The presence of DNAse or RNAase eliminates nuclear labeling, without affecting the poor background cytoplasmic labeling. Transport inhibition studies suggest that cBeet120 is internalized by L-glutamate transporters from the excitatory amino acid transporter (EAAT) family. The use of artemisinin for inhibition Ca2+-ATPases increases the rate of cBeet120 internalization in U87-MG cells. When irradiated with cyan colored light, cBeet120 within the nucleus of living cells is photoactivated, resulting in an increase in fluorescence intensity over time (monitored for 90 min) and the hypochromic shift of the emission maximum. In cells fixed with paraformaldehyde, the labeling pattern of the cell becomes more diffuse and the probe emits fluorescence without photoactivation. Fluorescence life-time measurements in solution and fluorescence life-time imaging microscopy allows to infer the occurrence of the formation of a protein-cBeet120 complex or the formation of a transimination product that may be subject to cis/trans isomerization

Antioxidant properties, quantification and stability of betalains from pitaya (Hylocereus undatus) peel / Propriedades antioxidantes, quantificação e estabilidade das betalaínas da casca da pitaya (Hylocereus undatus)

Pitaya peel can be used as a raw material for betalains extraction. The aim of this research was to quantify phenolic compounds, antioxidant activity and betalains on pitaya peel. Furthermore, evaluate the betalains stability against various pH conditions and exposure time of heating. The results showed that pitaya peel contains phenolic compounds and presented antioxidant activity. Moreover it showed high concentration of betalains (101.04mg equivalent to betanin. 100g-1) which were stable over a wide pH range (3.2 - 7.0) and were resistant to heating (100oC) up to 10 minutes at pH range from 3.7 to 5.5. Therefore, pitaya peel is a promising source of betalains which can be applied as a natural colorant for food.

A casca da pitaya pode ser utilizada como matéria prima para a extração de betalaínas. O objetivo deste trabalho foi quantificar os compostos fenólicos, atividade antioxidante e as betalaínas presentes na casca da pitaya. Além disso, foi avaliada a estabilidade das betalaínas em diferentes condições de pH e tempo de exposição ao aquecimento. Os resultados mostraram que a casca da pitaya contém compostos fenólicos e apresenta atividade antioxidante. Além disso, a casca da pitaya apresenta alta concentração de betalaínas (101,04mg equivalente a betanina. 100g-1) as quais apresentaram-se estáveis em uma ampla faixa de pH (3,2 - 7,0) e resistentes ao aquecimento (100oC) por até 10 minutos em uma faixa de pH de 3,7 a 5,5. Portanto, a casca da pitaya é uma fonte promissora de betalaínas as quais podem ser aplicadas como corante natural para alimentos.

Produção de betacianina em erva-de-jacaré cultivada in vitro com diferentes concentrações de sulfato de cobre / Betacyanin production in alligator weed, grown in vitro, with different concentrations of copper sulfate

A manipulação da concentração dos microelementos no meio de cultura representa uma boa estratégia para aumentar a produção de metabólitos secundários em cultura de tecidos. Este trabalho teve por objetivo demonstrar a influência do sulfato de cobre na produção de betacianina e na multiplicação de plantas de Alternanthera philoxeroides (erva-de-jacaré) cultivadas in vitro. Segmentos nodais, obtidos de plantas pré-estabelecidas e após três subcultivos, foram inoculados em meio MS, com diferentes concentrações de CuSO4 (0; 25; 75; 125; 175; 200µM). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com seis concentrações de CuSO4 e cinco repetições representadas por um frasco contendo quatro explantes. Os resultados foram submetidos à análise de variância, à regressão polinomial e a análises de correlação entre as variáveis morfológicas e a produção de betacianina. Concentrações acima de 75µM diminuíram a altura das plantas, o número de brotos e gemas e o crescimento radicular, enquanto que, na concentração de 125µM, houve a maior produção de massa fresca. A produção de betacianina aumentou 60 por cento em relação ao controle com 175µM de CuSO4. Ocorreu crescimento das plantas em todas as concentrações de CuSO4 testadas, com exceção de 200µM, sendo esta considerada tóxica.

The manipulation of concentration of trace elements in the culture medium represents a good strategy to increase the production of secondary metabolites in tissue culture. This study aimed to demonstrate the influence of copper sulphate in the production of betacyanin and the multiplication of plants of Alternanthera philoxeroides (alligator weed) cultured in vitro. Nodal segments, obtained from plants pre-stablished and after three subcultures, were inoculated in basic MS with different concentrations of CuSO4 (0, 25, 75, 125, 175, 200µM). The results were subjected to analysis of variance, polynomial regression and correlation analysis between the morphological variables and the production of betacyanin. The experimental design was completely randomized with six concentration of CuSO4 and five replicates represented by a bottle containing four explants. Concentrations above 75µM decreased the height of the plant, number of shoots and buds and root growth, while the concentration of 125µM resulted in the highest fresh mass production. Betacyanin production increased 60 percent over control with 175µM CuSO4. Plant growth occurred in all tested concentrations of CuSO4, with the exception of 200µM which was toxic.