Effect of periapical inflammation on calcium binding proteins and ERK in the trigeminal nucleus / Efecto de la inflamación periapical sobre las proteínas fijadoras de calcio y ERK en el núcleo trigeminal

Peripheral inflammation induces plastic changes in neurons and glia which are regulated by free calcium and calcium binding proteins (CaBP). One of the mechanisms associated with the regulation of intracellular calcium is linked to ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase) and its phosphorylated condition (pERK). ERK phosphorylation is important for intracellular signal transduction and participates in regulating neuroplasticity and inflammatory responses. The aim of this study is to analyse the expression of two CaBPs and pERK in astrocytes and neurons in rat trigeminal subnucleus caudalis (Vc) after experimental periapical inflammation on the left mandibular first molar. At seven days post-treatment, the periapical inflammatory stimulus induces an increase in pERK expression both in S100b positive astrocytes and Calbindin D28k positive neurons, in the ipsilateral Vc with respect to the contralateral side and control group. pERK was observed coexpressing with S100b in astrocytes and in fusiform Calbindin D28k neurons in lamina I. These results could indicate that neural plasticity and pain sensitization could be maintained by ERK activation in projection neurons at 7 days after the periapical inflammation.

La inflamación periférica induce cambios plásticos en las neuronas y en la glía, los cuales están regulados por el calcio libre y las proteínas fijadoras calcio (CaBP). Uno de los mecanismos asociados con la regulación del calcio intrace-lular está vinculado con la fosforilación de la pro teína quinasa ERK. Asimismo, ERK fosforilado es importante para la trans-ducción de señales intracelulares y participa en la regulación de la neuroplasticidad y las respuestas inflamatorias. El objetivo de este estudio es analizar la expresión de dos CaBPs y pERK en astrocitos y neuronas del subnúcleo caudal del trigémino (Vc) después de una inflamación periapical experimental en el primer molar inferior izquierdo en ratas. A los siete días posteriores al tratamiento, el estímulo inflamatorio periapical induce un aumento en la expresión de pERK, en el número de astrocitos positivos para la proteína marcadora astroglial S100b y en neuronas positivas para Calbindina D28k, en el Vc ipsilateral respecto del lado contralateral y el grupo de control. Además, se observó coexpresión de pERK tanto en astrocitos S100b positivos, como en neuronas fusiformes Calbindin D28k positivas, de la lámina I. Estas observaciones podrían indicar que la neuroplasticidad y la sensibilización al dolor podrían mantenerse mediante la activación de ERK en las neuronas de proyección a los 7 días de la inflamación periapical.

Entry of rabies virus in the olfactory bulb of mice and effect of infection on cell markers of neurons and astrocytes / Ingreso del virus de la rabia en el bulbo olfatorio de ratones y efecto de la infección en marcadores celulares de neuronas y astrocitos

There are few studies of infection by rabies virus in the olfactory bulb (OB). This work was carried out with the purpose of establishing the time required to detect rabies antigens in the OB of mouse, after the intramuscular inoculation of the virus and to evaluate the effect of the infection on the expression of three proteins: calbindin (CB), parvalbumin (PV) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP). Mice were inoculated with rabies virus intramuscularly in the hind limbs. Every 8 hours, after 72 hours postinoculation (p.i.), animals were sacrificed by perfusion with paraformaldehyde and coronal sections of OB were obtained for immunohistochemical study. These cuts were used to reveal the entry and spread of viral antigens. Tissue sections obtained in the terminal phase of the disease (144 hours p.i.), and controls of the same age were also processed for immunohistochemistry of CB, PV and GFAP. Rabies virus antigens were initially detected at 80 hours p.i. in a few mitral cells. At 88 hours p.i. the antigens had spread through most of these neurons but until the terminal phase of the disease there was little dispersion of the virus towards other cellular layers of the OB. The CB protein was expressed in cells of the glomerular stratum, the PV in cells of the outer plexiform layer and the GFAP was expressed in all the layers of the OB. Viral infection generated loss of CB expression and increase of PV expression. Immunoreactivity to GFAP was increased in the outer plexiform layer of the OB as a response to infection.

Son escasos los estudios de la infección por virus de la rabia en el bulbo olfatorio (OB). Este trabajo se realizó con el objetivo de establecer el tiempo requerido para detectar antígenos de rabia en el OB del ratón, luego de la inoculación intramuscular del virus y evaluar el efecto de la infección en la expresión de tres proteínas: calbindina (CB), parvoalbúmina (PV) y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los ratones fueron inoculados con virus de la rabia por vía intramuscular en las extremidades posteriores. Cada 8 horas, después de 72 horas de inoculación (p.i.), los animales se sacrificaron por perfusión con paraformaldehído y se obtuvieron secciones coronales de OB para el estudio inmunohistoquímico. Estos cortes se usaron para revelar la entrada y propagación de antígenos virales. Las secciones de tejido obtenidas en la fase terminal de la enfermedad (144 horas p.i.), y los controles de la misma edad también se procesaron para inmunohistoquímica de CB, PV y GFAP. Los antígenos del virus de la rabia se detectaron inicialmente a las 80 horas p.i. en unas pocas células mitrales. A las 88 horas p.i. los antígenos se habían diseminado a través de la mayoría de estas neuronas, pero hasta la fase terminal de la enfermedad había poca dispersión del virus hacia otras capas celulares del OB. La proteína CB se expresó en las células del estrato glomerular, la PV en células de la capa plexiforme externa y la GFAP se expresó en todas las capas del OB. La infección viral generó pérdida de expresión de CB y aumento en la expresión de PV. La inmunorreactividad a GFAP aumentó en la capa plexiforme externa del OB como respuesta a la infección.

La inmunorreactividad a calbindina en células de purkinje del cerebelo de ratones no es afectada por la infección con virus de la rabia / Immunoreactivity to calbindin in purkinje cells in the cerebellum of mice is not affected by rabies virus infection

Introducción: La calbindina (CB) es una proteína reguladora del calcio intracelular y la célula de Purkinje del cerebelo es la neurona con más alta concentración de CB. Se ha demostrado pérdida de inmunorreactividad a CB en diferentes áreas del sistema nervioso en ratones inoculados con virus de la rabia, pero faltaba estudiar este fenómeno en el cerebelo. Objetivo: Determinar el efecto de la inoculación con virus de la rabia sobre la expresión de CB en células de Purkinje del cerebelo de ratones. Metodología: Se inocularon ratones con el virus por vía intramuscular. Se sacrificaron los animales cuando alcanzaron la fase avanzada de la enfermedad y se fijaron mediante perfusión intracardiaca con paraformaldehído al 4%. Se les extrajo el cerebelo y se hicieron cortes sagitales de 50 micrómetros de espesor en un vibrátomo. Estos se procesaron mediante inmunohistoquímica para revelar la presencia de CB o de antígenos del virus de la rabia. El mismo procedimiento se realizó con animales no infectados (controles). Resultados: Las células de Purkinje fueron masivamente infectadas con el virus de la rabia. En las imágenes panorámicas observadas en el microscopio se comprobó que sólo estas células fueron inmunorreactivas a CB. No se hallaron diferencias significativas en la inmunorreactividad a CB, evaluada por densitometría óptica, entre los animales infectados y los controles. Conclusión: La expresión de CB en las células de Purkinje del cerebelo parece no afectarse por la infección con rabia, a diferencia de lo que se ha demostrado en otras áreas del sistema nervioso del ratón.

Introduction: Calbindin (CB) is a regulatory protein of intracellular calcium, and the cerebellar Purkinje cell is the neuron with the highest concentration of CB. Loss of CB immunoreactivity has been demonstrated in different areas of the nervous system in rabies virus-infected mice, but the study of this phenomena in the cerebellum lacked. Objective: To determine the effect of inoculation with rabies virus on the expression of CB in Purkinje cells of the cerebellum of mice. Methodology: Mice were intramuscularly inoculated with rabies virus. Animals were sacrificed when they reached an advanced stage of the disease and then they were fixed by intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde. Cerebellums were extracted and sagittal sections 50 microns thick were obtained in a vibratome. These were processed by immunohistochemistry to reveal the presence of CB protein or rabies virus antigens. The same procedure was performed with uninfected animals (controls). Results: Purkinje cells were massively infected with rabies virus. In the microscopic panoramic images observed was found that only these cells are immunoreactive to CB. No significant difference in CB immunoreactivity evaluated by optical densitometry was found between infected animals and controls. Conclusion: The expression of CB in Purkinje cells of the cerebellum appears not to be affected by infection with rabies unlike what has been shown in other areas of the mouse nervous system.

Efecto de la infección por el virus de la rabia sobre la expresión de parvoalbúmina, calbindina y calretinina en la corteza cerebral de ratones / Effect of rabies virus infection on the expression of parvalbumin, calbindin and calretinin in mouse cerebral cortex

Algunas manifestaciones clínicas de la rabia, así como los resultados de experimentos con cultivos celulares y animales de laboratorio han llevado a sugerir que el virus de la rabia afecta la neurotransmisión gabaérgica. En la corteza cerebral existen diferentes tipos de neuronas que sintetizan el neurotransmisor GABA. Éstas se pueden identificar con marcadores neuronales, entre los que se destacan tres proteínas ligadoras de calcio: la parvoalbúmina (PV), la calbindina (CB) y la calretinina (CR). El virus de la rabia se disemina a través de la corteza cerebral pero se desconocen sus posibles efectos citopáticos sobre las neuronas gabaérgicas. Para evaluar el efecto de la rabia sobre estas neuronas, se estudió mediante inmunohistoquímica la expresión de PV, CB y CR en la corteza frontal de ratones normales y ratones infectados con virus 'calle' o virus 'fijo' de la rabia. La PV se expresó en neuronas multipolares dispersas regularmente entre las capas II y VI, y en botones sinápticos que bordeaban el soma de las neuronas piramidales. La inmunorreactividad a CB se manifestó en dos franjas corticales: la primera, en las capas supragranulares II y III en neuronas con somas redondeados e inmersos en un neuropilo intensamente marcado; la segunda, en las capas infragranulares V y VI en neuronas multipolares dispersas y rodeadas por un neuropilo menos reactivo. La CR se expresó en neuronas bipolares con somas fusiformes distribuidas en las seis capas corticales, pero concentradas principalmente en las capas II y III. Hubo una característica común en las muestras infectadas con los dos tipos de virus: la inmunotinción a PV fue más intensa que en las muestras normales. La infección derivada del virus 'calle' no causó alteraciones adicionales en la expresión de las tres proteínas. En contraste, la infección con virus 'fijo' produjo una reducción notable del número de neuronas CB+, así como de la inmunorreactividad a CB en el neuropilo de la corteza frontal. Además, provocó una disminución significativa del tamaño de las neuronas CR+ en la corteza del cíngulo. Estos resultados aportan evidencia histológica en apoyo de la hipótesis según la cual las neuronas gabaérgicas son afectadas por el virus de la rabia.

Some clinical features of rabies and experimental evidence from cell culture and laboratory animals suggest impairment of gabaergic neurotransmission. Several types of gabaergic neurons occur in the cerebral cortex. They can be identified by three neuronal markers: the calcium binding proteins (CaBPs) parvalbumin (PV), calbindin (CB) and calretinin (CR). Rabies virus spreads throughout the cerebral cortex; however, rabies cytopathic effects on gabaergic neurons are unknown. The expression of calcium-binding proteins (CaBPs) parvalbumin (PV), calbindin (CB) and calretinin (CR) was studied in the frontal cortex of mice. The effect of gabaergic neurons was evaluated immunohistochemically. The distribution patterns of CaBPs in normal mice and in mice infected with 'fixed' or 'street' rabies virus were compared. PV was found in multipolar neurons located in all cortical layers except layer I, and in pericellular clusters of terminal knobs surrounding the soma of pyramidal neurons. CB-immunoreactivity was distributed in two cortical bands. One was composed of round neurons enclosed by a heavily labeled neuropil; this band corresponds to supragranular layers II and III. The other was a weakly stained band of neuropil which contained scattered multipolar CB-ir neurons; this corresponds to infragranular layers V and VI. The CR-ir neurons were bipolar fusiform cells located in all layers of cortex, but concentrated in layers II and III. A feature common to samples infected with both types of viruses was a more intense immunoreactivity to PV in contrast to normal samples. The infection with 'street' virus did not cause additional changes in the expression of CaBPs. However, the infection with 'fixed' virus produced a remarkable reduction of CB-immunoreactivity demonstrated by the loss of CB-ir neurons and low neuropil stain in the frontal cortex. In addition, the size of CR-ir neurons in the cingulate cortex was decreased.