Safety assessment of complex benzoic acid using in vitro permeation assays with pig skin in Franz cells / Evaluación de seguridad del ácido benzoico complejado empleando ensayos de permeación in vitro con piel de cerdo en celdas de Franz

SUMMARY Franz cells are one of the main tools to evaluate the transepithelial permeation of compounds through the performance of in vitro tests, these allows inferring the safety behavior of a compound in the skin. The objective of this research was to determine the permeation behavior of benzoic acid from complexes with polyelectrolytes (EuB 75 Cl 25 EuB 100), compared to benzoic acid without complexing, to infer its safety behavior. In a first phase, skin storage conditions were established comparatively evaluating the diffusion parameters (flow and permeation constant) and transepithelial water loss, using ears skin of freshly slaughtered pigs, stored in 1M NaCl at -2 °C for 3 days; it was worked under infinite doses conditions. Subsequently, the permeation test of two complexes between Eudragit E and benzoic acid, in comparison with benzoic acid, was carried out under finite dose conditions. The benzoic acid quantification was performed with an analytical method validated by HPLC-DAD. The results showed no significant differences showing that biological samples can be stored for 72 h under the conditions described. The permeation behavior of the complexed benzoic acid with respect to the free benzoic acid showed a better safety profile, since there was a lower permeation for the first case. These results show that complexation of benzoic acid could decrease the sensitivity reactions that it normally presents, based on the decrease in its permeation.

RESUMEN Las celdas de Franz son una de las herramientas para evaluar la permeación transe-pitelial de compuestos mediante la realización de ensayos in vitro, estos permiten inferir el comportamiento de seguridad de un compuesto en la piel. El objetivo de esta investigación fue determinar el comportamiento de permeación del ácido benzoico a partir de complejos con polielectrolitos (EuB 75 Cl 25 EuB 100) en comparación con el ácido benzoico sin complejar, para inferir su comportamiento de seguridad. En una primera fase, se establecieron las condiciones de almacenamiento de la piel comparando los parámetros de difusión (flujo y constante de permeación) y pérdida de agua transepitelial, empleando piel de orejas de cerdos recién sacrificados, almacenadas en NaCl 1M a -2°C por 3 días; se trabajó bajo condiciones de dosis infinitas. Posteriormente, se realizó el ensayo de permeación de dos complejos entre ácido benzoico y Eudragit E, en comparación con el ácido benzoico, bajo condiciones de dosis finitas. La cuantificación del ácido benzoico fue realizada con un método analítico validado por HPLC-DAD. Los resultados evidenciaron que las muestras biológicas pueden almacenarse durante 72 h en las condiciones descritas. El comportamiento de permeación del ácido benzoico complejado respecto al ácido benzoico libre demostró tener un mejor perfil de seguridad, puesto que hubo una menor permeación para el primer caso. Estos resultados demuestran que la complejación del ácido benzoico podría disminuir las reacciones de sensibilidad que normalmente este presenta, basándose en la disminución de su permeación.

Validación de una metodología analítica por HPLC-DAD para la cuantificación de ácido benzoico complejado, en un ensayo de permeación transdérmica in vitro empleando piel de cerdo / Validation of an analytical methodology by HPLC-DAD for the quantification of complexed benzoic acid, in an in vitro transdermal permeation assay using pig skin

RESUMEN En el presente estudio se realizó la validación de una metodología analítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación del ácido benzoico en complejos polielectrolíticos, obtenidos con Eudragit® E100. Para ello se evaluaron las características de desempeño determinando que la metodología es selectiva; lineal en el rango de concentraciones de 2 a 10 fíg/mL; precisa con un RSD inferior a un 2%; exacta con un porcentaje de recuperación de un 98,7% y se establecieron límites de cuantificación (LOQ) de 0,72 y de 1,56 (g/mL para el sistema y método respectivamente. De acuerdo a estos resultados, la metodología analítica es adecuada para evaluar la permeación in vitro, del ácido benzoico incluido en los complejos polielectrolíticos a través de piel porcina, empleando celdas de Franz.

SUMMARY This paper presents the studies carried out about the validation of an analytical methodology by high performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) for the quantification of benzoic acid in polyelectrolyte complexes obtained with Eudragit® E100. Performance characteristics of the methodology were evaluated, finding that this is selective; linear in the concentration range of 2 to 10 (g / mL; accurate with a RSD of less than 2%, exact with a recovery percentage of 98.7% and quantification limits of 0.72 and 1.56 fig / mL were established for the system and method respectively. According with this results, the analytical methodology is adequate to evaluate the in vitro permeation of benzoic acid, in polyelectrolyte complexes, through porcine skin in Franz cells.

Validación de una metodología analítica por HPLC-DAD para la cuantificación de cafeína en un ensayo de permeación in vitro empleando mucosa oral porcina / Validation of an analytical HPLC-DAD methodology for the quantification of caffeine in an in vitro permeation test using porcine buccal mucosa

RESUMEN En este artículo se presentan los resultados del desarrollo y validación de una metodología analítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de cafeína; se utilizó una columna C18 con detección UV a 273 nm y una fase móvil compuesta por agua/acetonitrilo (80:20 v/v) de modo isocrático. Las características de desempeño evaluadas permitieron comprobar que existe una adecuada selectividad, una linealidad entre 0,5 y 50 ug/mL, con una precisión expresada como RSD menor a 2%, un porcentaje de recuperación del 99,9% y unos límites de detección y cuantificación para el método de 2,99 y 2,69 ng/mL, respectivamente. El método propuesto es útil para determinar el perfil de permeación bucal de la cafeína mediante un estudio in vitro con celdas de Franz empleando membrana bucal porcina.

SUMMARY This paper presents the results of the development and validation of an analytical methodology through high performance liquid chromatography with a diode array detector (HPLC-DAD) for the quantification of caffeine, using a C18 reverse phase column with UV detection at 273 nm and a mobile phase consisting exclusively of water/acetonitrile (80:20 v/v). The evaluated performance characteristics allowed to verify that there is an adequate selectivity, a linearity between 0.5 and 50 /µg/mL, with precision expressed as RSD in less than 2%, a recovery rate of 99.9%, and limits of detection and quantification for the method of2.99 and 2.69 ng/mL respectively. The proposed method is useful for determining the oral permeation profile of caffeine by an in vitro study with Franz cells using porcine buccal membrane.

Permeación en piel humana de una nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada para la optimización de tratamientos tópicos de leishmaniasis cutánea / Human Skin Permeation of a Chloroaluminum Phthalocyanine Nanoemulsion for Optimization of Topical Cutaneous Leishmaniasis Formulations / Permeação em pele humana de uma nanoemulsão de ftalocianina de alumínio clorada para a otimização de tratamentos tópicos de leishmaniose cutânea

Introducción: Las nanoemulsiones son excelentes sistemas de transporte y entrega de fármacos. La ftalocianina de aluminio clorada (PcAlCl) en terapia fotodinámica constituye una alternativa de tratamiento en leishmaniasis cutánea. Objetivo: Determinar la difusión y retención en piel humana de la PcAlCl contenida en una nanoemulsión (nano-PcAlCl) para su optimización en formulaciones tópicas. Materiales y métodos: Se prepararon y caracterizaron fisico-químicamente dos formulaciones (nano-PcAlCl y solución-PcAlCl) y sus vehículos sin-PcAlCl. La permeación se determinó en ensayos en celdas de difusión de Franz y la retención por el método de la cinta adhesiva. La concentración de PcAlCl fue determinada fluorométricamente (nM/cm2). Biopsias de piel fueron analizadas histotécnicamente. Resultados: El tamaño promedio, el potencial Z y el índice de polidispersión de la nano-PcAlCl en agua fue de 132,9 nm, -19,23 y 0,14 y diluida en PBS fue 125,33 nm, -13,69 y 0,139. Las concentraciones de PcAlCl se mantuvieron estables. La PcAlCl no atravesó la piel y fue retenida en sus capas, en estrato córneo y epidermis+dermis con valores de 44,17 nM y 8,48 nM postratamiento con nano-PcAlCl, y 96,90 nM y 9,80 nM postratamiento con solución-PcAlCl. Esta última promovió mayor retención en estrato córneo y ambas formulaciones promovieron similar retención en epidermis+dermis. Se observó desprendimiento del estrato córneo y fragmentación del colágeno. Conclusión: La PcAlCl no atravesó la piel, se retuvo en estrato córneo y epidermis+dermis. Se sugiere realizar ensayos de permeación utilizando piel humana desprovista de estrato córneo y ensayos de distribución en animales con leishmaniasis cutánea.

Introduction: The nanoemulsions constitute excellent drug delivery systems for carrying and delivering active drugs. Chloroaluminum phthalocyanine (ClAlPc) in photodynamic therapy constitutes an interesting alternative in cutaneous leishmaniasis treatment. Objective: To determine the diffusion and retention of ClAlPc contained in a nanoemulsion (nano-ClAlPc) in human skin membranes for optimization of topical formulations. Materials and methods: Two formulations (ClAlPc-nano- and ClAlPc-solution) and vehicles without ClAlPc were prepared and physicochemical characterized. The permeation was tested in Franz-diffusion cells and the retention by the tape stripping method. ClAlPc concentration was determined fluorometrically (nM/cm2). Skin biopsies were analyzed by histologic technics. Results: The ClAlPc-nano average size, zeta potential and polydispersity index diluted in water was 132.9 nm, -19.23 and 0.14 and diluted in phosphate-buffer-saline was 25.33 nm, -13.69 and 0.139. ClAlPc maintains its stability in each formulation. ClAlPc was unable to pass completely through the skin; it was retained in the different skin layers. A ClAlPc retention in stratum corneum and epidermis+dermis was observed with values of 44.17 nM and 8.48 nM after ClAlPc-nano treatment and 96.90 nM and 9.80 nM after ClAlPc-solution treatment. The ClAlPc-solution promoted greater retention in stratum corneum and both formulations showed similar ClAlPc-retention in epidermis+dermis. Histological changes as stratum corneum detachment and collagen-fragmentation were observed. Conclusion: ClAlPc was not able to cross completely the skin, it was retained in stratum corneum and epidermis+dermis Human permeation test using skin membranes without stratum corneum, and distribution assays in cutaneous leishmaniasis-infected animals, are suggested.

Introdução: as nanoemulsões são excelentes sistemas de transporte e entrega de fármacos. A ftalocianina de alumínio clorada (PcAlCl) em terapia fotodinâmica constitui uma alternativa de tratamento em leishmaniose cutânea. Objetivo: determinar a difusão e retenção em pele humana da PcAlCl contida em uma nanoemulsão (nano-PcAlCl) para sua otimização em formulações tópicas. Materiais e métodos: se prepararam e caracterizaram fisico-quimicamente duas formulações (nano-PcAlCl e solução-PcAlCl) e seus veículos sem-PcAlCl. A permeação determinou-se em ensaios em celas de difusão de Franz e a retenção pelo método da fita adesiva. A concentração de PcAlCl foi determinada fluorometricamente (nM/cm²). Biopsias de pele foram analisadas histotecnicamente. Resultados: o tamanho médio, o potencial Z e o índice de polidispersão da nano-PcAlCl em água foi de 132,9 nm, -19,23 e 0,14 e diluída em PBS foi 125,33 nm, -13,69 e 0,139. As concentrações de PcAlCl mantiveram-se estáveis. A PcAlCl não atravessou a pele, foi retido em suas capas. A PcAlCl foi retida em estrato córneo e epiderme+derme com valores de 44,17 nM e 8,48 nM pós-tratamento com nano-PcAlCl e 96,90 nM e 9,80 nM pós-tratamento com solução-PcAlCl. A solução-PcAlCl promoveu maior retenção em estrato córneo e ambas as formulações promoveram similar retenção em epiderme+derme. Observou-se desprendimento do estrato córneo e fragmentação do colágeno. Conclusão: a PcAlCl não atravessou a pele; reteve-se em estrato córneo e epiderme+derme. Sugere-se realizar ensaios de permeação utilizando pele humana desprovida de estrato córneo e ensaios de distribuição em animais com leishmaniose cutânea.

Estandarización de celdas de Franz para la realización de ensayos de liberación de fármacos a partir de complejos con polielectrolitos / Standardization of Franz cells to evaluate drugs release from drug-polyelectrolyte complexes

En el presente estudio se realizó la estandarización de las condiciones de operación de algunas celdas de Franz, sistema que permite realizar la evaluación de la liberación de compuestos biológicamente activos como una de sus aplicaciones. Para ello se seleccionaron y caracterizaron dos complejos obtenidos entre Eudragit® y ácido benzoico como modelos a emplear, de acuerdo con su solubilidad. Se evaluó su comportamiento de liberación en diferentes condiciones operacionales del ensayo y los resultados se evaluaron empleando el modelo de Korsmeyer-Peppas y el análisis estadístico correspondiente. El análisis de Korsmeyer-Peppas demostró que el mecanismo de liberación del ácido benzoico se ajusta a la ley de difusión de Fick, en algunos casos. Las condiciones operacionales definidas para el ensayo de liberación en las celdas de Franz fueron las siguientes: la concentración del ácido benzoico en la dispersión de complejo en el compartimento donor, 0,07%; la velocidad de agitación, 400 rpm; el volumen de muestreo, 1 mL y la frecuencia de muestreo según un esquema determinado. Se demostró la reproducibilidad del ensayo de liberación en las condiciones operacionales definidas, mediante análisis de varianza.

This paper presents the studies carried out about the standardization of the operational conditions of some Franz Cells; this system allows evaluating the drug release, among others. To this purpose, two Eudragit E- benzoic acid complexes were selected and characterized, as models due to their solubility. After that, the outstanding operational variables were established and evaluated at different levels. The delivery profiles analysis applying the Korsmeyer-Peppas model showed that the release mechanism of benzoic acid was Fick diffusion, in some cases. The operational conditions: benzoic concentration in the complex dispersion in the donor compartment, 0,07%; agitation speed, 400 rpm; volume (1 mL) and frequency sampling according to specific scheme, were determined. The delivery assay reproducibility was demonstrated in the established operational conditions by statistically analysis (ANOVA).