Aislamiento e identificación de microorganismos potencialmente amilolíticos y celulolíticos de suelos de humedales de Bogotá / Isolation and identification of potential amylolytic and cellulolytic microorganisms from soil of Bogota wetlands

RESUMEN Las amilasas y celulasas de origen microbiano se han utilizado desde hace más de tres décadas en la industria. El aislamiento de microorganismos nativos con capacidad amilolítica y celulolítica es el punto de partida para aprovechar la biodiversidad microbiana en la producción de amilasas y celulasas con características específicas que permitan obtener nuevos productos y optimizar procesos industriales donde estas sean aplicables. El objetivo de este trabajo fue aislar, a partir de suelo de cinco humedales en Bogotá, cepas microbianas productoras de enzimas amilolíticas y celulolíticas. Se realizó la medición de halos de hidrólisis en agar almidón y agar carboximetilcelulosa. Se evaluó la actividad enzimática por medio de la producción de azúcares reductores, determinados mediante la técnica del ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se seleccionaron cuatro aislamientos amilolíticos diferentes, todos identificados como Bacillus amyloliquefaciens, con actividades entre 480±35 y 752±33 U/mL a 60°C. Cinco aislamientos celulolíticos diferentes fueron seleccionado, dos identificados como Bacillus amyloliquefaciens, dos como Yersinia massiliensis y uno como Stenotrophomonas nitritireducens, con actividades enzimáticas entre 13.82 ± 2.5 y 19.11 ± 2.3 U/mL a 50°C. Estos resultados demuestran que dentro de la biodiversidad de los suelos de humedales de Bogotá existen microrganismos productores de amilasas y celulasas que podrían ser aplicadas en procesos industriales.

ABSTRACT The amylases and cellulases obtained from microorganisms have been used since more than three decades in industry. The isolation of native microbial strains with amylolytic and cellulolytic ability is the starting point to make the best of microbial biodiversity and support the production of amylases and cellulases with novel characteristics to obtain new products and optimize industrial processes where these enzymes can be applied. The objective of this work was to isolate microbial strains with the capacity to produce amylolytic and cellulolytic enzymes from the soil of five wetlands in Bogotá. Hydrolysis halos measurements in starch agar and carboxymethylcellulose agar were performed. The enzymatic activity was determined through the production of reducing sugars which were determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method. Four different amylolytic isolations were selected and all of them were identified as Bacillus amyloliquefaciens. The amylolytic activity was between 480 ± 35 and 752±33 U/mL at 60°C. Five different cellulolytic strains were selected and two of them were identified as Bacillus amyloliquefaciens, two as Yersinia massiliensis and one as Stenotrophomonas nitritireducens. Their cellulolytic activities were from 13.82 ± 2.51 to 19.11 ± 2.3 U/mL at 50°C. These results demonstrate that as a part of the Bogota wetlands soil biodiversity there are microorganisms producing amylases and cellulases which might be applied in industrial processes.

Isolation, biochemical characterization, and phylogeny of a cellulose-degrading ruminal bacterium / Aislamiento, caracterización bioquímica y filogenia de una bacteria ruminal degradadora de celulosa / Isolamento, caracterização bioquímica e filogenia de uma bacteria ruminal degradante de celulose

Abstract Background: The isolation of cellulolytic bacteria, which hydrolyze cellulose to cellobiose and glucose, can provide useful information about rumen diversity. Objective: To identify and characterize a microorganism capable of hydrolyzing cellulose, isolated from a cow rumen. Methods: Anaerobic culture techniques were used for isolating cellulose-degrading rumen bacteria. Congo red staining was used to evaluate β-D-glucanase activity, and carbohydrate fermentation pattern was obtained with the kit API 50CHB/E. DNA extraction was performed and the 16S rDNA gene was amplified using 8F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), and 1492R (5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3') primers. The phylogenetic tree was reconstructed with the algorithm of maximum parsimony (bootstrap 5000), and 16S rDNA sequence was deposited in the NCBI database (accession number: KM094184). Results: The isolated bacterium showed cellulolytic activity detected with Congo red; besides, glycerol, ribose, xylose, sucrose, galactose and glucose were fermented by this bacterium. However, biochemical tests did not identify the bacteria because no match was found at database of API WEB Software. The phylogenetic inference indicated that this bacterium belongs to Shigella genus, with 98% maximal identity respect to the other taxonomic species. Conclusions: Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes showed that the rumen isolated bacterium was a member of the genus Shigella, which, under mesophilic conditions, is an interesting candidate for obtaining oligosaccharides from lignocellulosic biomass.

Resumen Antecedentes: El aislamiento de las bacterias celulolíticas, que hidrolizan la celulosa a celobiosa y glucosa, proporciona valiosa información sobre la diversidad del rumen. Objetivo: Identificar y caracterizar un microorganismo capaz de hidrolizar celulosa, aislado de un rumen vacuno. Métodos: Se utilizaron técnicas de cultivo anaeróbico para aislar bacterias ruminales que degradan celulosa. La tinción con rojo Congo se usó para evaluar la actividad β-D-glucanasa y el patrón de fermentación de carbohidratos se obtuvo con el kit API 50CHB/E. Se realizó la extracción de DNA y se amplificó el gen de 16S rDNA utilizando los cebadores 8F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), y 1492R (5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'). El árbol filogenético se reconstruyó con el algoritmo de máxima parsimonia (replicas 5000) y la secuencia 16S rDNA se depositó en la base de datos del NCBI (número de acceso: KM094184). Resultados: La bacteria aislada mostró actividad celulolítica detectada con la tinción de rojo Congo; además, esta bacteria fermenta glicerol, ribosa, xilosa, sacarosa, galactosa y glucosa. Sin embargo, las pruebas bioquímicas no permitieron identificar a la bacteria aislada, por no encontrar coincidencias en la base de datos del software API WEB. La inferencia filogenética indicó que esta bacteria pertenece al género Shigella, con 98% de identidad máxima respecto a las otras especies taxonómicas. Conclusiones: El análisis filogenético del gen 16S rRNA mostró que la bacteria aislada del rumen es un miembro del género Shigella que, en condiciones mesófilas, es un candidato interesante para obtener oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósica.

Resumo Antecedentes: As bactérias celulolíticas hidrolizam a celulosa em celobiose e glicose, e o isolamento desses microrganismos fornece informações sobre a diversidade do rúmen. Objetivo: Identificar e caracterizar um microorganismo isolada do rúmen de uma vaca, com capacidade para hidrolisar a celulose. Métodos: Técnicas de cultura anaeróbica foram utilizadas para isolar bactérias ruminais que degradam a celulose. A atividade β-D-glucanase foi mostrada utilizando mancha de vermelho Congo, e o padrão de fermentação de carbohidratos foi obtida com o kit API 50CHB/E. A extracção foi realizada de DNA e amplificou-se os genes 16S rDNA utilizando os iniciadores 8F (AGA GTT TGA 5'-TCC TGG CTC AG-3'), e 1492R (5' CTT GGT TAC GTT ACG TCA T 3'). A árvore filogenética foi reconstruída com o algoritmo de máxima parcimônia (réplicas 5000). A sequência de rDNA 16S foi depositada no banco de dados do NCBI (número de acesso: KM094184). Resultados: O isolado mostrou uma atividade celulolítica com coloração vermelho Congo; además esta bactéria fermentação de glicerol, ribose, xilose, sacarose, galactose e glicose. No entanto, com as provas bioquímicas não se identificou a bactérias isolada, já que não se encontrou na base de dados do software API WEB. A inferência filogenética indicou que esta bactéria pertence ao género Shigella, com 98% de identidade de máximo respeito para outras espécies taxonômicas. Conclusão: A análise filogenética do gene 16S rRNA mostrou as bactérias isoladas do ambiente ruminal como um membro do género Shigella, que condições mesofilicas é um candidato atraente para obter oligossacarídeos da biomassa lignocelulósica.

Evidencia molecular de la ocurrencia de bacterias celulolíticas del género Cohnella en especies neotropicales de Nasutitermitinae colectadas en el NEA / Molecular evidence that cellulolytic bacterial genus Cohnella is widespread among Neotropical Nasutitermitinae from NE Argentina

Cohnella is a highly cellulolytic bacterial genus, which can be found in a variety of habitats. The aim of this study was to assess its presence in the digestive tract of termite species collected in North-eastern Argentina: Nasutitermes aquilinus, N. corniger and Cortaritermes fulviceps. Gut homogenates were incubated with cellulosic substrate for bacterial growth. Bacterial 16S rDNA was partially amplified using new primers for Cohnella spp. and cloned. Sequences obtained showed highest similarity (97.2-99.9%) with those of Cohnella spp. previously reported from diverse environments. Phylogenetic analysis tended to group the clones according to their host species and sampling sites. These results indicate the association of Cohnella-related intestinal symbionts with three common Neotropical termites. Their potential industrial application encourages further research.

Cohnella es un género de bacterias celulolíticas que puede ser encontrado en una variedad de hábitats. El propósito de este estudio fue registrar su presencia en el tracto digestivo de termitas (Nasutitermes aquilinus, N. corniger y Cortaritermes fulviceps) colectadas en el noreste argentino (NEA). Se incubaron homogenados de intestinos en sustrato celulósico para multiplicar las bacterias. Utilizando nuevos cebadores para Cohnella spp., se amplificó una porción del ADN ribosomal 16S bacteriano, el cual fue posteriormente clonado. Las secuencias obtenidas mostraron su mayor porcentaje de similitud (97,2-99,9%) con Cohnella spp., previamente reportadas en diversos ambientes. El análisis filogenético tendió a agrupar a los clones de acuerdo a la especie hospedante y al sitio de muestreo. Estos resultados indican que especies de termitas frecuentes en el NEA albergan simbiontes intestinales relacionados con el género Cohnella. Las potenciales aplicaciones industriales de estos microorganismos animan a profundizar los estudios.

RICHNESS, CELLULOLYTIC ACTIVITY, AND FUNGICIDE SUSCEPTIBILITY OF FUNGI FROM A BIRD BIOLOGICAL COLLECTION / Riqueza, actividad celulolítica y susceptibilidad a fungicidas de hongos de una colección biológica de aves

Biological collections in natural history museums serve important purposes to the scientific community and the general public, however, their value and utility might be diminished by biodeterioration. We studied a biological collection that represents more than sixty years of avifauna sampling of Colombia, the country with the highest bird diversity. An initial inspection of the collection showed that the general appearance of some specimens was compromised by mold-like growth on their surfaces. We aimed at (i) identifying the taxonomic affiliation of these fungi, (ii) evaluating their cellulolytic activity, and (iii) probing chemical agents that could be utilized to control their growth. The most common fungi genera were Aspergillus, Penicillium, Chaetomium, and Trichophyton, most of which can degrade cellulose. Zinc chloride and salicylic acid showed to be effective fungicides. Based on this, we propose some actions to control the fungi-pest in this biological collection of birds.

Las colecciones biológicas en los museos de historia natural juegan un papel importante tanto para la comunidad cientifica como para el público en general. Sin embargo, su valor y utilidad pueden verse afectados por la biodeterioración de sus ejemplares. Se estudio una colección biológica de aves que representa más de sesenta anos de esfuerzo de muestreo de la avifauna del pais más rico en aves. Una inspección inicial mostró que la apariencia general de algunos de los especimenes de la colección se encontraba afectada por hongos. Los objetivos de este estudio fueron (i) identificar la afiliación taxonómica de los hongos, (ii) determinar la actividad celulolítica y (iii) probar agentes químicos que puedan ser utilizados para controlar su desarrollo. Los géneros de hongos más comunes fueron Aspergillus, Penicillium, Chaetomium y Trichophyton, de los cuales la mayoria presentan la capacidad de degradar celulosa. Adicionalmente, el cloruro de zinc y el ácido salicilico actuaron como fungicidas efectivos. De acuerdo con en estos resultados proponemos algunas acciones para controlar la contaminación por hongos en la colección de aves.

Aspergillus sclerotiorum: riesgo para la herencia cultural y la salud / Aspergillus sclerotiorum: a risk to cultural heritage and health Abstract / Aspergillus sclerotiorum: risco para a herança cultural e para a saúde

A partir de una mancha de enmohecido de un libro del Archivo "Coronado" con valor patrimonial, se obtuvo una cepa fúngica mediante aislamiento en medio de cultivo micológico. La cepa fué Aspergillus sclerotiorum y se identificó por secuenciación de ADN ribosomal. Se evaluó y confirmó su capacidad deteriorante sobre el papel, al determinar cualitativamente las actividades enzimáticas celulolítica, proteolítica y amilolítica, así como la producción de pigmentos y ácidos. Se evaluaron cuantitativamente sus actividades enzimáticas celulasa total sobre papel de filtro (FPasa) y &beta-endoglucanasa, FPasa y &beta-endoglucanasa; confirmando actividades bajas. Aunque su capacidad deteriorante es discreta, resulta ser amenza para la conservación del documento y potencialmente peligroso para la salud de las personas que consultan y archivan.

By performing a mycological culture, we isolated a fungal strain from a mold patch in a book of great heritage value from the "Coronado" archives. Ribosomal DNA sequencing identified the strain as Aspergillus sclerotiorum. By qualitatively determining its cellulolytic, proteolytic and amylolytic and enzymatic activities, as well as the production of pigments and acids, we confirmed its paper deteriorating abilities. Quantitatively, we evaluated its total cellulase enzyme activities on filter paper (FPase) and &beta-endoglucanase, and FPase and &beta-endoglucanase; confirming low activities. Although its deteriorating abilities are weak, it poses a threat to the preservation of the document and is a potential health hazard to the people who refer to and archive these books.

A partir de uma mancha de bolor de um livro do Arquivo "Coronado" com valor patrimonial, obteve-se uma cepa fúngica mediante isolamento em meio de cultura micologica. A cepa foi Aspergillus sclerotiorum e identificou-se por sequenciação de ADN ribossomal. Avaliou-se e confirmou-se a sua capacidade deteriorantesobre o papel, ao determinar qualitativamente as atividades enzimáticas celulósica, proteolitica e amiolitica, assim como a produção de epigmentos e ácidos. Avaliaram-se quantitativamente as suas atividades enzimáticas celulase toral sobre o papel de filtro (FPasa) e &beta-endoglucanasa, FPasa e &beta-endoglucanasa; confirmando atividades baixas. Apesar da sua capacidade deteriorante ser discreta, resulta ser ameaçante para a conservação do documento e potencialmente perigoso para a saúde das pessoas que consultam e arquivam.