Aplicación de PCR a partir de cultivo en la identificación de subespecies del complejo Mycobacterium Tuberculosis / The use of culture-based PCR for the identification of subspecies of the mycobacterium tuberculosis complex

Los métodos diagnósticos clásicos de tuberculosis (TB) se basan en la utilización de baciloscopía y cultivo. La identificación del agente etiológico desde la positivización del cultivo requiere entre 10 y 15 días, mientras que el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) disminuye el tiempo a 24 h, lo que permite no solo identificar las subespecies del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) sino también diferenciarlas de otras especies ambientales clínicamente importantes (MOTT) facilitando el diagnóstico y tratamiento. El objetivo del presente trabajo fue determinar la utilidad de la PCR en la identificación temprana de las micobacterias pertenecientes al CMTB, a partir de cultivos positivos, de pacientes con sospecha de TB, atendidos en un hospital pediátrico de alta complejidad, durante un período de cuatro años. A cada muestra, se le realizó baciloscopía y cultivo en medio líquido. A los cultivos positivos, una inmunocromatografía lateral (TBIDR) y luego PCR. El 4,6% del total de muestras (510/11.162) pertenecientes a 198 pacientes presentó cultivos positivos. Cuatrocientos veintiseis (84%) correspondieron a muestras respiratorias. El rendimiento de la baciloscopía directa fue del 41% (194/470). Cuatrocientos treinta y ocho (86%) resultaron M. tuberculosis, 21 (4%) Mycobacterium bovis, 7 (1%), M. bovis-BCG y 44 (9%) MOTT. La utilización de medios de cultivos líquidos junto con el empleo de PCR favorecen una rápida orientación microbiológica y constituye una estrategia útil para optimizar el manejo clínico de estas infecciones, desde el punto de vista terapéutico y epidemiológico, especialmente en pediatría (AU)

Classical diagnostic methods for tuberculosis (TB) are based on the use of smear microscopy and culture. The identification of the etiological agent from positive culture requires 10 to 15 days, while the use of the polymerase chain reaction (PCR) reduces the time to 24 h, which allows not only to identify the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) but also to differentiate them from clinically important environmental mycobacteria other than tuberculosis (MOTT), facilitating diagnosis and treatment. The aim of this study was to determine the usefulness of PCR in the early identification of mycobacteria belonging to the MTC, from positive cultures of patients with suspected TB seen in a pediatric tertiary hospital over a 4-year period. For each sample, smear microscopy and culture in liquid medium was performed. Positive cultures were subjected to lateral immunochromatography (TBIDR) and then PCR. Of the total number of samples (510/11,162) belonging to 198 patients, 4.6% showed positive cultures; 426 (84%) were respiratory samples. The direct smear microscopy yield was 41% (194/470). Overall, 438 (86%) were found to be M. tuberculosis, 21 (4%) Mycobacterium bovis, 7 (1%), M. bovis-BCG, and 44 (9%) MOTT. The use of liquid culture media together with the use of PCR favors a rapid microbiological orientation and is a useful strategy to optimize the clinical management of these infections, from a therapeutic and epidemiological point of view, especially in children (AU)

Comparación del sistema BacT/ALERT® 3D con los métodos de cultivo Lowenstein-Jensen y Ogawa-Kudoh para el aislamiento de micobacterias / Comparison of BacT/ALERT 3D® system with the culture methods of Lowenstein-Jensen and Ogawa-Kudoh, for the isolation of mycobacteria

La tuberculosis es una enfermedad causada por bacterias pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis. El diagnóstico se dificulta por su sintomatología inespecífica y los métodos bacteriológicos que ofrecen resultados tardíos. El objetivo del presente estudio fue comparar el desempeño del sistema automatizado BacT/ALERT® 3D con los métodos convencionales de cultivo en medio Lowenstein-Jensen (L-J) y Ogawa-Kudoh (O-K) para el aislamiento de micobacterias. Se procesaron 266 muestras provenientes de pacientes con sospecha de tuberculosis entre mayo y octubre de 2013. Se aislaron 63 bacilos acido-resistentes: 46 M. tuberculosis y 17 micobacterias no tuberculosas (MNT). Al comparar los tres métodos, se observó que todos presentaron desempeño similar en el aislamiento de M. tuberculosis. Las tasas de recuperación obtenidas no mostraron diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) sin embargo, con BacT/ALERT® 3D se aislaron mayor número de MNT, con diferencia significativa respecto al L-J (p<0,05). El tiempo de detección promedio de M. tuberculosis fue de 11 días por BacT/ALERT® 3D, 20 días en L-J y 23 días en O-K. La contaminación cruzada, fue de 0,38%. Se concluyó que BacT/ALERT® 3D es una excelente herramienta para el aislamiento de M. tuberculosis, mejora la recuperación de las MNT y reduce significativamente el tiempo de diagnóstico, lo que permitiría un tratamiento oportuno, con mayor probabilidad de sobrevida del paciente.

Tuberculosis is a disease caused by species of the Mycobacterium tuberculosis complex. The diagnosis is difficult due to nonspecific symptoms and late results of bacteriological culture methods. The aim of this study was to compare the efficiency of the BacT/ALERT® 3D automated system with conventional methods of culture on Lowenstein-Jensen (L-J) and Ogawa-Kudoh (O-K). A total of 266 specimens from patients with clinical suspected tuberculosis were studied from May to October 2013. We recovered, 63 acid fast bacilli isolates: 46 identified as M. tuberculosis and 17 as nontuberculous mycobacteria (NTM). The three methods had a similar performance for isolation of M. tuberculosis; recovery rates obtained showed no statistically significant difference (p> 0.05). However, with the BacT/ALERT® 3D system, a larger number of MNT were isolated, with significant statistic difference for L-J (p <0.05). The average detection time for M. tuberculosis was 11 days with the BacT/ALERT® 3D system, with significant statistic difference for LJ (20.4 days) and O-K (23.2 days). Additionally, cross-contamination was determined as 0.38%. The study results showed that the BacT/ALERT® 3D system is an excellent tool for isolation of M. tuberculosis and it improves the recovery of NTM. Also, the time of diagnosis is significantly reduced, leading to earlier treatment that could improve patient recovery.

Tipificación con oligonucleótidos espaciadores de Mycobacterium tuberculosis en Cuba / Spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis in Cuba

Introducción: el conocimiento de los linajes de Mycobacterium tuberculosis es importante para entender el origen, evolución y propagación de la bacteria. Objetivo: determinar los patrones genéticos de M. tuberculosis circulantes en Cuba. Métodos: estudio descriptivo de corte transversal con un componente analítico en Cuba, en el período comprendido de enero de 2009 a diciembre de 2010. Se aplicó la tipificación con oligonucleótidos espaciadores (Spoligotyping) a 308 aislamientos de M. tuberculosis del período 2009-2010. La clasificación en genotipos se realizó según la base de datos internacional SpolDB4. Los resultados se analizaron además con la herramienta web en línea MIRU-VNTRplus y se compararon con los patrones genéticos de M. tuberculosis identificados en 1993-1995 en Cuba. Resultados: se definieron 79 patrones genotípicos diferentes, de los cuales 46 (62 por ciento) fueron patrones no reportados anteriormente en SpolDB4. Los 22 agrupamientos definidos incluyeron al 75,4 por ciento de los aislamientos estudiados. Se encontraron cinco familias genéticas fundamentales: Beijing (25,6 por ciento), S (19,2 por ciento), LAM (16,9 por ciento), Haarlem (16,9 por ciento) y T (5,8 por ciento). La familia S prevaleció en la región Occidental (OR=3,4; 95 por ciento IC:1,8-6,3; p<0,05), Beijing en el Centro de Cuba (OR=6,7; 95 por ciento IC:3,7-11,9; p<0,05) y LAM (OR=3,0; 95 por ciento IC:1,6-5,6; p<0.05) y Haarlem en la zona Oriental (OR=1,8; 95 por ciento IC:1,0-3,4; p<0,05). Conclusiones: se observó una gran diversidad genética entre los aislamientos de M. tuberculosis circulante en Cuba en 2009-2010. En el país, la estructura genética de la población de M. tuberculosis ha variado en el tiempo con una disminución de genotipos endémicos como Haarlem y T y un aumento significativo de S y Beijing. Estos datos aportan elementos importantes para la epidemiología y control de la TB en Cuba(AU)

Introduction: knowledge about Mycobacterium tuberculosis lineages is important to understand the origin, evolution and spread of this bacterium. Objective: determine the genetic patterns of M. tuberculosis circulating in Cuba. Methods: adescriptive cross-sectional study was conducted with an analytical component in Cuba in the period extending from January 2009 to December 2010. Spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) was applied to 308 M. tuberculosis isolates from the period 2009-2010. Classification into genotypes was carried out according to the international database SpolDB4. Results were additionally analyzed with the online tool MIRU-VNTRplus and compared with the M. tuberculosis genetic patterns found in Cuba in 1993-1995. Results: 79 different genotypic patterns were defined, of which 46 (62 percent) had not been previously reported in SpolDB4. The 22 clusters defined included 75.4 percent of the isolates studied. Five main genetic families were found: Beijing (25.6 percent), S (19.2 percent), LAM (16.9 percent), Haarlem (16.9 percent) and T (5.8 percent). The S family prevailed in the Western region (OR=3.4; CI 95 percent:1.8-6.3; p<0.05), Beijing in Central Cuba (OR=6.7; CI 95 percent:3.7-11.9; p<0.05), and LAM (OR=3.0; CI 95 percent:1.6-5.6; p<0.05) and Haarlem in the Eastern region (OR=1.8; CI 95 percent:1.0-3.4; p<0.05). Conclusions: great diversity was observed among the M. tuberculosis isolates circulating in Cuba in the period 2009-2010. The genetic structure of M. tuberculosis has changed in the country with the passing of time, with a reduction in endemic genotypes like Haarlem and T, and a significant increase in S and Beijing. These data contribute important information for epidemiology and TB control in Cuba(AU)

Presencia del genotipo Beijing entre cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis en dos centros de salud de la Región Metropolitana-Chile / Presence of Bejing genotype among Mycobacterium tuberculosis strains in two centres of the Region Metropolitana of Chile

Background: Genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex (cMtb) allows us to know geographically predominant lineages. Some lineages spread more rapidly and are associated with multidrug resistance, particularly Beijing, which has been reported in Latin America (Peru). There is little information about this topic in Chile and there are no reports of the presence of the Beijing genotype. Aim: To determine the most prevalent lineages in the Metropolitan Region of Chile with emphasis on the search for Beijing in two health centers. Methods: Two complementary molecular methods were used: spoligotyping, based on the variations of the direct repeat regions in the genome of cMtb and MIRU-VNTR, based in the variable number of tandem repeats of mycobacterial interspersed repetitive units, and subsequent analysis in international databases. A designed lineage was assigned to 37 of the 43 strains studied (86%); 6 isolates could not be assigned to any genotype. LAM and T genotype were the most frequent (39.5 and 32.5%, respectively) followed by Haarlem (7.0%), Beijing (4.7%) and X (2.3%). Conclusion: We describe for the first time the presence of the Beijing genotype in Chile. cMtb molecular surveillance should be implemented in our country in order to know the dynamics of its transmission.

Introducción: La genotipificación del complejo Mycobacterium tuberculosis (cMtbc) permite conocer los genotipos geográficamente predominantes. Algunos genotipos se diseminan con mayor rapidez y se asocian a multi-resistencia, tal como Beijing, reportado en América Latina en Perú. Existe poca información al respecto en Chile, sin reportes de la presencia de Beijing. Objetivo: Conocer los genotipos prevalentes en dos centros de salud de la Región Metropolitana de Chile con énfasis en la búsqueda de Beijing. Métodos: Se utilizaron dos métodos moleculares complementarios basados en la variación de las regiones de repeticiones directa en el genoma de M. tuberculosis (espoligotipificación) y número variable de repeticiones en tandem de las unidades repetitivas de interespaciadores micobacterianos (MIRU-VNTRs) y posterior análisis en bases de datos internacionales. Resultados: Se asignó un genotipo conocido a 37 de las 43 cepas estudiadas (86%), mientras que en 14% no se asignó alguno. Los genotipos LAM y T fueron los más frecuentes (39,5 y 32,5%, respectivamente), seguidos por Haarlem (7,0%), Beijing (4,7%) y X (2,3%). Conclusión: Se describe por primera vez en Chile la presencia del genotipo Beijing en cepas de cMtb. Es necesario realizar una vigilancia epidemiológica molecular en el cMtb para conocer la dinámica de la transmisión en nuestro país.

Evaluación de un ensayo de RPC múltiple para diferenciar micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis en un laboratorio de referencia / Evaluation of a multiplex PCR assay to differentiate mycobacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex in a reference laboratory

Mycobacteria that cause tuberculosis in animals and humans belong to the Mycobacterium tuberculosis complex. Techniques for conventional diagnosis are time-consuming and do not differentiate between different strains belonging to the M. tuberculosis complex. The aim of this study was to evaluate a multiplex PCR assay applicable to mycobacteria in culture with the capacity to differentiate different strains belonging to the M. tuberculosis complex in a reference laboratory. Primers based on genomics regions of difference (RD) consisting in DNA segments that are present in M. tuberculosis, but differentially deleted in several members of M. tuberculosis complex were used in a PCR assay. The test was applied to 86 clinical isolates of mycobacteria. The pattern of amplification allowed differentiating between M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG in a single PCR reaction. This PCR multiplex assay may be used in a Reference Laboratory of Tuberculosis Diagnosis as a complementary test to differentiate mycobacteria strains belonging to the M. tuberculosis complex. This test significantly reduces the time period between culture and strain identification, and thus for could favor the adoption of better strain specific antimycobacterial regimens as well as identification of zoonotic transmission of M. bovis to humans.

Las micobacterias que causan tuberculosis en animales y humanos pertenecen al complejo Mycobacterium tuberculosis. Las técnicas de diagnóstico convencional, además de ser lentas y laboriosas, no permiten diferenciar entre miembros de este complejo. El objetivo de este estudio fue evaluar ensayos de RPC múltiple para contribuir a la identificación diferencial de micobacterias del complejo M. tuberculosis a partir de cultivos, en un laboratorio de referencia. Se utilizaron oligonucleótidos partidores basados en regiones de diferencia (RD) que consisten en segmentos de ADN que están presentes en M. tuberculosis, pero que han sido eliminados diferencialmente del genoma de otros miembros del complejo M. tuberculosis. El ensayo se aplicó sobre 86 aislados clínicos de micobacterias. El patrón de amplificación permitió diferenciar entre cepas de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis variedad BCG en una única RPC. Este ensayo de RPC múltiple puede ser utilizado en el Laboratorio de Referencia de Diagnóstico de Tuberculosis como prueba complementaria para diferenciar micobacterias del complejo M. tuberculosis, contribuyendo a un acortamiento en el período de reporte de resultados y un tratamiento adecuado del paciente, y podría ser aplicado también en estudios epidemiológicos de transmisión zoonótica de M. bovis a humanos.