Crioconservación seminal en peces de agua dulce: aspectos biotecnológicos, celulares y bioquímicos / Seminal Cryopreservation in Freshwater Fish: Biotechnological, Cellular and Biochemical Aspects / Criopreservação Seminal em Peixes de Água Doce: Aspectos Biotecnológicos, Celulares e Bioquímicos

Resumen La crioconservación es una herramienta biotecnológica que en peces está orientada principalmente a la conservación criogénica de semen como estrategia de preservación del recurso genético y a su uso para la producción de alevinos con fines diferentes. Actualmente, los protocolos de crioconservación seminal en peces de agua dulce establecen una amplia variedad de procedimientos cuya efectividad se basa en aspectos ligados a la calidad seminal post-descongelación y la fertilidad, así como su relación con el desarrollo de la progenie. El efecto de la conservación del semen en nitrógeno líquido por periodos amplios de tiempo también toma importancia en ésta biotecnología. Por lo anterior, el objetivo de la presente revisión es describir aspectos biotecnológicos, celulares y bioquímicos asociados al proceso de crioconservación seminal en peces dulceacuícolas, resaltando los avances, las limitaciones y sus perspectivas.

Abstract Cryopreservation is a biotechnological tool that in fish is mainly aimed at cryogenic conservation of semen as a strategy for preserving the genetic resource and its use for the production of fingerlings with different purposes. Currently, seminal cryopreservation protocols in freshwater fish establish a wide variety of procedures whose effectiveness is based on aspects linked to seminal post-thaw quality and fertility, as well as its relationship with the development of the progeny. The effect of preserving semen in liquid nitrogen for extended periods of time also plays an important role in this biotechnology. Therefore, the objective of this review is to describe biotechnological, cellular and biochemical aspects associated with the seminal cryopreservation process in freshwater fish, highlighting the advances, limitations and perspectives.

Resumo A criopreservação é uma ferramenta biotecnológica que em peixes visa principalmente a conservação criogênica do sêmen como estratégia para a preservação do recurso genético e sua utilização para a produção de alevinos para diferentes fins. Atualmente, os protocolos de criopreservação seminal em peixes de água doce estabelecem uma ampla variedade de procedimentos cuja eficácia se baseia em aspectos relacionados à qualidade e fertilidade pós-descongelamento seminal, bem como sua relação com o desenvolvimento da progênie. O efeito da preservação do sêmen no nitrogênio líquido por longos períodos de tempo também desempenha um papel importante nessa biotecnologia. Portanto, o objetivo desta revisão é descrever aspectos biotecnológicos, celulares e bioquímicos associados ao processo de criopreservação seminal em peixes de água doce, destacando os avanços, limitações e perspectivas.

Critical vitrification steps towards survival of Garcinia hombroniana (Clusiaceae) shoot tips after cryopreservation / Etapas críticas de vitrificación para la supervivencia de ápices caulinares de Garcinia hombroniana (Clusiaceae) después de crioconservación

Abstract A cryopreservation protocol was developed for in vitro shoot tips of Garcinia hombroniana using the vitrification technique. Four critical steps in the technique were investigated, namely preculture, loading, dehydration with Plant Vitrification Solution 2 (PVS2), and unloading. Shoot tips precultured for 48 h gave significantly higher survival (75 %) compared to 24 h preculture (50 %) after cryopreservation. Treatment with 1 M glycerol plus 0.4 M sucrose as a loading solution gave higher survival (45.83 %) compared to the other treatments (0.4 M sucrose + 2 M glycerol; 0.4 M sucrose). Shoot tips dehydrated with PVS2 for 25 min gave the highest survival after immersion in liquid nitrogen. Stepwise PVS2 treatment for 15 min with 50 % PVS2 followed by 10 min with 100 % PVS2 solution improved survival of the shoot tips after cryopreservation (41.67 %). Murashige and Skoog medium with 0.4 M sucrose gave significantly higher survival (66.67 %) than MS with 1.2 M sucrose (25 %) as an unloading solution. Water content was shown to decrease throughout the whole vitrification steps from 6.83 ± 1.66 g g-1 dw for fresh shoot tips down to 2.93 ± 0.28 g g-1 dw after PVS2 treatment. Further study on each step including recovery medium is required to improve the survival. Nevertheless, the present study showed the potential of using the vitrification technique for cryopreservation of G. hombroniana. Rev. Biol. Trop. 66(3): 1314-1323. Epub 2018 September 01.

Resumen Se desarrolló un protocolo de crioconservación in vitro para ápices caulinares de Garcinia hombroniana mediante la técnica de vitrificación, con cuatro etapas críticas: precultivo, carga de crioprotector, deshidratación con solución de vitrificación vegetal 2 (PVS2), y descarga. Ápices precultivados por 48 h sobrevivieron más (75 %) que los de 24 h (50 %) después de la crioconservación. El tratamiento con glicerol 1 M más sacarosa 0.4 M como solución de carga permitió mayor sobrevivencia (45.83 %) que los otros tratamientos (sacarosa 0.4 M + glicerol 2 M; sacarosa 0.4 M). Los ápices deshidratados con PVS2 por 25 min registraron la mayor sobrevivencia tras inmersión en nitrógeno líquido. El tratamiento gradual por 15 min con solución de PVS2 al 50 %, seguido por 10 min al 100 %, mejoró la sobrevivencia de ápices tras la crioconservación (41.67 %). El medio Murashige-Skoog (MS) con sacarosa 0.4 M produjo una sobrevivencia significativamente mayor (66.67 %) que MS con sacarosa 1.2 M (25 %) como solución de descarga. El contenido de agua disminuyó a lo largo del proceso de vitrificación desde 6.83 ± 1.66 g g-1 peso seco, en ápices frescos, hasta 2.93 ± 0.28 g g-1 peso seco después del tratamiento con PVS2. Se requiere de más investigación sobre cada etapa, incluyendo el medio de recuperación, para mejorar la tasa de sobrevivencia. Sin embargo, este estudio muestra el potencial de la vitrificación para la crioconservación de G. hombroniana.

Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo / Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 10(8) cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico.

The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 10(8) cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis.

Cryopreservation of Trans-Andean shovelnose catfish (Sorubim cuspicaudus) semen using dimethylacetamide / Criopreservación de semen de Bagre blanco (Sorubim cuspicaudus) con dimetilacetamida como crioprotector / Criopreservação de sêmen de Bagre branco (Sorubim cuspicaudus) com dimetilacetamida como crioprotetor

Cryoprotectant solutions of dimethylacetamide (DMA) were used at three inclusion levels (8, 10, and 12%) to evaluate cryopreservation of Trans-Andean shovelnose catfish semen. The solutions also included 6% glucose and 5% skimmed milk powder. Osmolarity of the solutions was measured with an osmometer (Precision System, Osmomette III, USA). Semen was diluted at a 1:4 ratio (semen:solution) and frozen in nitrogen vapors using a dry shipper (MVE 4/2V, USA). Concentration, mobility, speed, and progressivity of cryopreserved and fresh semen (control) were assessed with the SCA® Sperm Class Analyzer (Microptic, Spain) computer-assisted program. Fertility and hatching were evaluated fertilizing one gram of oocytes with cryopreserved and fresh semen, which was then kept in 2L cylinder-conical incubators. The osmolarity of cryoprotective solutions was 1233.3 ± 23.1 mOsm/Kg (8%DMA), 1530 ± 0.0 mOsm/Kg (10% DMA), and 1627.7 ± 5.8 mOsm/Kg (12% DMA). Fresh semen showed better total mobility (99.6 ± 0.4%), percentage of rapid sperm (34.7 ± 12.2%), and progressivity (48.2 ± 12.8%), compared with cryopreserved semen (p<0.05). Cryopreserved semen with 8% DMA had the highest total mobility (55.4 ± 13.6%) (p<0.05) as well as the highest percentage of rapid sperm (1.5-2.5%), total progressivity (1.9 to 10.1%), and curvilinear velocity (29,5-35,9 μm/s) without significant difference with the evaluated DMA percentages (p> 0.05). Fertilization with fresh semen (19.5 ± 4.4%) and 8% DMA cryopreserved semen (17.8 ± 8.3%) were not different (p>0.05). A cryoprotective solution composed of 8% DMA, 6% glucose, and 5% skimmed milk powder is a viable alternative to cryopreserve Trans-Andean shovelnose catfish semen.

Para evaluar la crioconservación de semen de bagre blanco utilizando dimetilacetamida (DMA) fueron preparadas soluciones crioprotectoras con DMA a tres porcentajes de inclusión (8, 10 y 12%), glucosa 6% y leche en polvo descremada 5%. La osmolaridad de las soluciones fue medida con osmómetro (Precision System, Osmomette III, Usa). El semen fue diluido a razón de 1:4 (semen:solución) y congelado con vapores de nitrógeno en dry shipper (MVE 4/2v, Usa). La concentración, movilidad total, velocidad y progresividad del semen crioconservado y fresco (control) fue evaluada con el programa asistido por computador Sperm Class Analyzer SCA® (Microptic, España). La fertilidad y eclosión se evaluaron fertilizando un gramo de ovocitos con semen crioconservado y fresco; mantenidos en incubadoras cilindro-cónicas de 2L. La osmolaridad de las soluciones crioprotectoras fue 1233,3 ± 23,1 mOsm/kg (DMA 8%), 1530 ± 0,0 mOsm/kg (DMA 10%) y 1627,7± 5,8 mOsm/kg (DMA 12%). Semen fresco mostró la mejor movilidad total (99,6±0,4%), porcentaje de espermatozoides rápidos (34,7 ± 12,2%) y progresividad (48,2 ± 12,8%), valores estadísticamente diferentes a los obtenidos con semen crioconservado (p<0,05). La mayor movilidad total se registró con semen crioconservado con DMA 8% (55,4 ± 13,6%) (p<0,05); así como los mayores porcentajes de espermatozoides rápidos (1,5-2,5%), progresividad total (1,9-10,1%) y velocidad curvilínea (29,5-35,9 µm/s) sin presentar diferencia significativa con los diferentes porcentajes de DMA evaluados (p>0,05). La fertilización con semen fresco (19,5 ± 4,4%) y semen crioconservado con DMA 8% (17,8 ± 8,3%) no presentó diferencia significativa (p>0,05). La solución crioprotectora compuesta por DMA 8%, glucosa 6% y leche en polvo descremada 5% es una alternativa viable para la crioconservación de semen de bagre blanco.

Para avaliar a criopreservação de sêmen de bagre branco utilizando dimetilacetamida (DMA) foram preparadas soluções crioprotetoras com DMA a três porcentagens de inclusão (8, 10 e 12%), glucose 6%e leite em pó desnatada 5%. A osmolaridade das soluções foi medida com osmômetro (Precision System, Osmomette III, USA). O sêmen foi diluído em razão de 1:4 (sêmen: diluição) e congelado com vapores de nitrogênio em dry shipper (MVE 4/2v, USA). A concentração, mobilidade total, velocidade e progressividade do sêmen criopreservado e fresco (controle) foi avaliado com o programa assistido por computador Sperm Class Analyzer SCA® (Microptic, Espanha). A fertilidade e eclosão avaliaram-se fertilizando uma grama de ovócitos com sêmen criopreservado e fresco, mantidos em incubadoras cilindro-cônicas de 2L. A osmolaridade das soluções crioprotetoras foi de 1233,3 ± 23,1 mOsm/kg (DMA 8%); 1530 ± 0,0 mOsm/kg (DMA 10%) e 1627,7 ± 5,8 mOsm/kg (DMA 12%). O sêmen fresco mostrou a melhor mobilidade total (99,6 ± 0,4%), a porcentagem de espermatozoides rápidos (34,7 ± 12,2%) e de progressividade (48,2 ± 12,8%), esses valores com sêmen fresco são estatisticamente diferentes aos obtidos com sêmen criopreservado (p<0,05). A maior mobilidade total registrou-se com sêmen criopreservado com DMA 8% (55,4 ± 13,6%) (p<0,05); assim como as maiores porcentagens de espermatozoides rápidos (1,5-2,5%), progressividade total (1,9-10,1%) e velocidade curvilínea (29,5-35,9 µm/s) sem apresentar diferença significativa com as diferentes porcentagens de DMA avaliados (p>0,05). A fertilização com sêmen fresco (19,5 ± 4,4%) e sêmen criopreservado com DMA 8% (17,8 ± 8,3%) não apresentou diferença significativa (p>0,05). A solução crioprotetora composta por DMA 8%, glucose 6% e leite em pó desnatada 5% é uma alternativa viável para a criopreservação de sêmen de bagre branco.

Colombian froze biodiversity: 16 years of the tissue collection of the humboldt intiitute / La biodiversidad congelada de Colombia: 16 años de la colección de tejidos del Instituto Humboldt

Collections of frozen tissue samples stand as keystone sources of molecular information to construct biodiversity knowledge, and are particularly challenged if they focus on megadiverse countries. In 1998 the Humboldt Institute (Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt) began a tissue collection of Colombian biodiversity (IAvH-CT) and the aim of this work is to present a diagnostic and an historical perspective for that collection, constructed by compiling information and experiences on its management as well as by organizing and curating the information of each catalogued sample. After 16 years, the IAvH-CT harbors 16,469 samples, which represent around 2530 species from 1289 genera, and 323 families of the Colombian biodiversity. Samples are biased toward plants (44 %) and birds (40 %), but also include other animal taxa. Geographically, IAvH-CT includes samples from all Colombian departments, but there is broad variation in their coverage. When compared with other international collections, IAvH-CT fulfills several standards of sample storage and data management, but its major weakness is that several tissues seem to lack a vouchered specimen. Tissues housed at IAvH-CT have been included in at least 48 studies published in several scientific journals. IAvH-CT is implementing strategies to improve curatorial standards, fill-in taxonomic gaps, and to explore the potential of its samples to understand the outstanding Colombian biota in a cooperative research framework among institutions.

Las colecciones de tejidos son fuentes fundamentales de información molecular para el conocimiento de la biodiversidad, y son particularmente desafiantes si están enfocadas en países megadiversos. En 1998 el Instituto Humboldt (Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt) inició una colección de tejidos de la biodiversidad colombiana (IAvH-CT). El objetivo de este trabajo es presentar un diagnóstico y una perspectiva histórica de esta colección, mediante la compilación de información y de experiencias sobre su manejo y organizando y curando la información de cada muestra catalogada. Después de 16 años IAvH-CT resguarda 16,469 muestras, que representan alrededor de 2530 especies de 1289 géneros y 323 familias de la biodiversidad colombiana. El número de muestras está sesgado hacia plantas (44 %) y aves (40 %), pero también incluyen otros taxones animales. Geográficamente, IAvH-CT incluye muestras de todos los departamentos colombianos, pero hay una gran variación en su cobertura. Al ser comparada con otras colecciones internacionales se encuentra que IAvH-CT cumple varios estándares de almacenamiento de muestras y de manejo de datos, pero su gran debilidad es que varios tejidos aparentemente carecen de un ejemplar de referencia. Varios tejidos almacenados en IAvH-CT han sido incluidos en al menos 48 estudios publicados en varias revistas científicas. IAvH-CT está implementando estrategias para mejorar la curaduría, llenar vacíos taxonómicos y explorar el potencial de sus muestras para entender la impresionante biota colombiana en un marco de investigación en cooperación con otras instituciones.

Effect of freezing and thawing rates on sperm motility in Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes) / Efecto de la congelación y descongelación sobre movilidad espermática en Bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces, Characiformes)

Objective. To determine the freezing and thawing rates necessary to maintain sperm viability during cryopreservation of Bocachico semen. Materials and methods. Four interactional treatments were implemented between two freezing (rapid and slow) and two thawing (rapid and slow) curves, in a 2x2 factorial as follows: rapid freezing-rapid thawing, rapid freezing-slow thawing, slow freezing-rapid thawing, and slow freezing-slow thawing. After thawing by Sperm Class Analyzer (SCA) curvilinear velocity (VCL) and straight-line (VSL) (μm sec-1) were analyzed; total, rapid, medium, and slow motility, were compared among treatments. Results. The rapid freezing-slow thawing treatment was lethal for all variables of velocity and motility, causing a significant (p<0.01) post-thaw inmotility of 100%. The slow freezing-rapid thawing interaction had a significantly higher effect than the other treatments (p<0.05), particularly on variables such as rapid motility (10.1 ± 1.1%), medium motility (30.16 ± 4.1%), and curvilinear velocity (51.5 ± 4.75 μm sec.-1) also decreased the percentage of sperm with slow motility (41.7 ± 4.45%). Independently of the applied thawing rate, the freezing rate generated the main significant effect on total motility. Conclusions. It is possible to conclude that the interaction effect between freezing and thawing rates is nil (except for slow motility) during cryopreservation process. However, the independent effects of these factors (main effects) on remaining motility variables are positively significant and decisive to the maintenance of these features, especially the freeze factor (when it is slow). This becomes the first successful report of sperm cryopreservation from Bocachico Prochilodus magdalenae in the world and may be used in conservation programs for this endangered species.

Objetivo. Determinar la tasa de congelación y descongelación para mantener la viabilidad espermática durante la crioconservación seminal de Bocachico. Materiales y métodos. Fueron implementados cuatro tratamientos de interacción entre dos curvas de congelación (rápida, lenta) y dos curvas de descongelación (rápida, lenta) en un factorial 2x2, así: congelación rápida-descongelación rápida, congelación rápida-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida y congelación lenta-descongelación lenta. Posterior a la descongelación espermática y mediante el software Sperm-Class-Analyzer, fueron analizadas la velocidad curvilínea (VCL) y lineal (VSL) (µm sec-1); movilidad total, rápida, media y lenta, y fueron comparadas entre tratamientos. Resultados. El tratamiento congelación rápida-descongelación lenta fue letal para las variables de velocidad y movilidad espermática, causando una significativa (p<0.05) inmovilidad pos-descongelación (100%). La interacción congelación lenta-descongelación rápida tuvo un efecto significativamente mejor (p<0.05) que los demás tratamientos, particularmente sobre variables como movilidad rápida (10.1 ± 1.1%), movilidad media (30.16 ± 4.1%) y velocidad curvilínea (51.5 ± 4.75 µm sec.-1), así mismo, generó una disminución del porcentaje de espermatozoides con movilidad lenta (41.7 ± 4.45%). La tasa de congelación posee un efecto principal significativo sobre la movilidad total. Conclusiones. El efecto de la interacción entre las tasas de congelación y la descongelación es nulo (excepto para la movilidad lenta), sin embargo, los efectos independientes de estos factores (efectos principales) sobre el resto de variables de movilidad son positivamente significativos y determinantes para el mantenimiento de aquellas características, especialmente el factor congelación (cuando es lento). Este es el primer reporte exitoso de crioconservación espermática de Bocachico P. magdalenae en el mundo, pudiendo ser usado en programas de conservación de esta especie en riesgo de extinción.

Conservación de cepas vacunales de Leptospira en nitrógeno líquido / Preservation for vaccinal strains of Leptospira at liquid nitrogen

INTRODUCCIÓN: las cepas de Leptospira interrogans que integran la vacuna cubana vax-SPIRAL® son conservadas en medio semisólido de Fletcher, el cual garantiza el mantenimiento de la viabilidad de las células por pocos meses. OBJETIVO: en este estudio, se evaluó la crioconservación en nitrógeno líquido de 6 variantes de crioprotectores como método de conservación a largo plazo de las cepas de Leptospira interrogans, utilizadas como antígenos en la vacuna antileptospirósica vax-SPIRAL®. MÉTODOS: la viabilidad se evaluó periódicamente según el rendimiento celular alcanzado por las cepas recién descongeladas en medio EMJH. La estabilidad de la virulencia fue estimada en hámster. La antigenicidad antes y después de la crioconservación fue comparada mediante microaglutinación, frente a una batería de antisueros de referencia correspondientes a los serogrupos vacunales. RESULTADOS: solo el empleo de dimetilsulfóxido a 2,5 y 5 por ciento, y glicerol 2,5 por ciento como agentes crioprotectores permitió una rápida recuperación de las 3 cepas, tras 19 meses de crioconservación sin afectación de su virulencia y antigenicidad. CONCLUSIONES: los resultados obtenidos demuestran la factibilidad de la crioconservación en nitrógeno líquido con un apropiado agente crioprotector, como método de conservación de cepas vacunales de Leptospira.

INTRODUCTION: Leptospira interrogans strains of Cuban vaccine vax-SPIRAL®are preserved in Fletcher's semi-solid medium, which guarantees the preservation of the cell viability for a few months. OBJECTIVE: to evaluate the cryopreservation at liquid nitrogen of 6 different cryoprotectors as a long-term preservation method for Leptospira interrogans strains used as antigens in vaccine vax-SPIRAL® against leptospirosis. METHODS: viability was systematically evaluated according to the cell yield of the recently thawed strains in EMJH medium. Virulence stability was estimated in hamsters and antigenicity was evaluated by microscopic agglutination test using reference antisera from vaccinal serogroups. RESULTS: the use of 2.5 percent and 5 percent dimethyl sulfoxide, and 2.5 percent glycerol allowed quick recovery of the three strains without virulence or antigenicity depletion after 19 months of cryopreservation. CONCLUSIONS: the results showed the feasibility of the cryopreservation at liquid nitrogen using suitable cryoprotectant as a preservation method for vaccinal strains of Leptospira.

Crioconservació de semen en peces: efectos sobrela movilidad espermática y la fertliidad. / Semen Cryopreservation in Fish: Effects on Sperm Motility and Fertility.

La crioconservación de semen de peces, como de otras especies, presenta aún efectos que disminuyen la calidad espermática y comprometen directamente la capacidad de la célula para participar exitosamente en los procesos de fertilización y desarrollo embrionario. Características como movilidad y capacidad de fertilización del espermatozoide son consideradas criterios de calidad que permiten medir el éxito o fracaso del proceso, pues se consideran variables integradoras, siendo indicadores que dependen no de un solo factor sino de la estabilidad y bienestar del conjunto de estructuras, enzimas y compuestos funcionales subcelulares que dan lugar a estas características espermáticas. Daños en la membrana (adenilato ciclasa, canales iónicos, agrupamiento de otras proteínas, entre otras) y su implicación en la ruta de señalización que da lugar a la activación espermática, degradación del ATP, fragmentación del ADN nuclear y mitocondrial (genoma), degradación de enzimas Kinasas y otras proteínas citosólicas (proteoma) son considerados hoy día como algunos de los factores moleculares que más se afectan durante la crioconservación y que disminuyen ostensiblemente la capacidad fertilizante y la movilidad del espermatozoide en los peces. Propuestas sobre los mecanismos moleculares por los cuales se interrelacionan y actúan estos factores subcelulares como consecuencia de la crioconservación, son algunos de los temas tratados en la presente revisión. Comprender los principios y factores que están involucrados en el origen de dichos daños, permitirá mejorar los procesos de crioconservación, haciéndolos menos nocivos y más eficientes.

The cryopreservation of semen in fish, as in many species even shows effects that decrease sperm quality and directly engage cell ability to successfully participate in the processes of fertilization and embryonic development. The characteristics such as mobility and fertilizing capacity of fertilization of sperm are considered to be quality criteria that allow to measure the success or failure of the process, since they are considered integrative variables, being indicators that depend not on a single factor, but on the stability and welfare of all structures, enzymes and subcellular functional compounds that give place to these spermatic characteristics. Membrane damage (adenylate cyclase, ion channels, grouping of other proteins, among others) and their implication in the route of signaling pathway leading to spermatic activation, ATP degradation and fragmentation of nuclear and mitochondrial DNA (genome), degradation of kinase enzymes and other cytosolic proteins (proteome) are considered today, as some of the molecular factors that most affect during cryopreservation and markedly decreasing the fertilizing capacity and mobility of sperm in fish. Proposals on the molecular mechanisms, by which these subcellular factors interact and act as consequence of cryopreservation are some of the topics covered in this review. Understanding the principles and factors that are involved in the origin of such damages, will allow to improved cryopreservation processes, making them less harmful and more efficient.

Conservación de cepas vacunales de Leptospira a -70 ºC / Preservation of vaccine strains of Leptospira at - 70 °C

Se evaluó la crioconservación a - 70 ºC con 9 variantes de crioprotectores como método de conservación de las cepas de Leptospira interrogans, utilizadas como antígenos en la vacuna antileptospirósica vax-SPIRALâ. La viabilidad se evaluó periódicamente según el rendimiento celular alcanzado por las cepas recién descongeladas en medio EMJH. La estabilidad de la virulencia fue estimada en hámster. La antigenicidad antes y después de la crioconservación fue comparada mediante microaglutinación frente a antisueros de referencia. Solo el empleo de dimetilsulfóxido a 2,5 y 5 % o leche descremada 5 % como agentes crioprotectores permitió una rápida recuperación de las 3 cepas tras 7 meses de crioconservación sin afectación de su virulencia y antigenicidad, mientras el glicerol tuvo un efecto variable sobre el grado de recuperación de las cepas evaluadas. Los resultados obtenidos demuestran la factibilidad de la crioconservación a - 70 ºC con un apropiado agente crioprotector como método de conservación de cepas vacunales de Leptospira.

The goal of this study was to evaluate the cryopreservation at -70ºC with the use of 9 different cryoprotectants as a preservation method for the strains of Leptospira interrogans used as antigens in the leptospiral vaccine vax-SPIRALâ. Viability was systematically evaluated according to the cell yield achieved by the just thawed strains in EMJH medium. Virulence stability was estimated in Hamsters and antigenicity was evaluated by microscopic agglutination test using reference antisera before and after cryopreservation. Only the use of 2,5% and 5% dimethyl sulfoxide or 5% skim milk allowed a quick recovery of the three strains without virulence or antigenicity depletions after 7 months of cryopreservation while glycerol had a variable effect on the degree of recovery of each strain. The results showed the feasibility of the cryopreservation at -70 °C with the use of a suitable cryoprotectant as a preservation method for vaccine strains of Leptospira.