Validation of a one-tube nested real-time PCR assay for the detection of Cryptosporidium spp. in avian fecal samples / Validação da nested PCR em tempo real em um tubo para detecção de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de aves

Abstract The aim of this study was to validate a one-tube nested real-time PCR assay followed by genetic sequencing to detect and identify Cryptosporidium species and genotypes in birds. A total of 443 genomic DNA extracted from avian fecal samples were analyzed by one-tube nested real-time PCR and conventional nested PCR. By one-tube nested real-time PCR, 90/443 (20.3%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. by conventional nested PCR. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. An evaluation of analytical specificity did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability analysis showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). As for the reproducibility of one-tube nested real-time PCR, 24 of the 30 samples examined (80%) showed the same result. All the 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR were successfully sequenced, leading to the identification of C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium avian genotype I. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was successful in 10/36 (27.8%) of positive samples.

Resumo O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. Um total de 443 amostras de DNA genômico, extraído de amostras fecais de aves, foi analisado pela nPCR-TR-1T e pela nested PCR convencional. Pela nPCR-TR-1T, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. de 20,3% (90/443), em contraste com a nested PCR convencional, que apresentou positividade de 8,1% (36/443). O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 80% (24/30) das amostras examinadas. Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T, com identificação de C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/36 (27,8%) das amostras positivas.

Aplicación de la metodología de las fuerzas motrices y el modelo OMS de determinantes sociales de la salud tomando como ejemplo la criptosporidiosis en Colombia / Application of the driving forces methodology and the WHO model of social determinants of health taking cryptosporidiosis in Colombia as an example / Aplicação da metodologia forças motrizes e do modelo de determinantes sociais da saúde da OMS, tomando a criptosporidiose como exemplo na Colômbia

RESUMEN Objetivos Analizar la relación que existe entre la contaminación de agua por ooquistes de Cryptosporidium spp. y los efectos en la salud de las poblaciones humanas y animales en Colombia. Métodos Es un ensayo de tipo analítico que se centró en la aplicación documentada y analizada, de la metodología de las "Fuerzas Motrices" y el modelo OMS de Determinantes Sociales de la Salud tomando como ejemplo la Criptosporidiosis. Resultados Las "fuerzas motrices" involucradas en la relación entre contaminación de agua por Cryptosporidium spp. y la salud de humanos y animales fueron el aumento en la demanda de productos pecuarios y la producción pecuaria de baja calidad; la "presión" consistió en la mala implementación de prácticas de producción, la invasión de zonas protegidas y de reservas ecológicas, y la disminución de fronteras entre lo rural y lo urbano; el "estado" se basó en la contaminación del suelo y las fuentes de agua, y en la deficiencia en el manejo de las excretas; la "exposición" radicó en la entrada de ooquistes vía fecal-oral, por la contaminación del suelo y el agua, y el "efecto" consistió en una diarrea autolimitante, una deshidratación severa, el síndrome de mala absorción y la muerte. Conclusiones Los ecosistemas pueden mantener poblaciones saludables, pero cuando son mal administrados o rápidamente alterados debido a la presión humana, también pueden estar asociados con la aparición de enfermedades, como la Criptosporidiosis.(AU)

ABSTRACT Objectives To analyze the relationship between water contaminated with Cryptosporidium spp. oocysts and its effects on the health of human and animal populations in Colombia. Materials and Methods Analytical essay focused on the documented and analytical application of the Driving Forces Methodology and the WHO model of Social Determinants of Health using cryptosporidiosis as an example. Results The driving forces involved in the relationship between water contaminated with Cryptosporidium spp. oocysts and human and animal health were increased demand for livestock products and low-quality livestock production. Regarding pressure, it was related to the poor implementation of production practices, the invasion of protected areas and ecological reserves, and the reduction of rural-urban borders. On the other hand, status was associated with contamination of soil and water sources, as well as the deficient management of excreta. Finally, exposure was determined by the entry of oocysts via the fecal-oral route through contaminated soil and water, and effect consisted of self-limiting diarrhea, severe dehydration, malabsorption syndrome, and death. Conclusions Ecosystems can maintain healthy populations, but when they are mismanaged or rapidly altered by human pressure, they can also be associated with the emergence of diseases such as Cryptosporidiosis.(AU)

OBJETIVOS Analisar a relação entre contaminação da água por Oocistos de Cryptosporidium spp. e os efeitos sobre a saúde das populações humanas e animais na Colômbia. MÉTODOS Trata-se de um estudo de tipo analítico que se concentrou na aplicação documentada e analisada da metodologia "Forças de Condução" e do modelo da OMS de Determinantes Sociais da Saúde, tomando a criptosporidiose como exemplo. RESULTADOS As "forças motrizes" envolvidas na relação entre contaminação da água por Cryptosporidium spp. e saúde humana e animal foram o aumento da demanda por produtos animais e a produção animal de baixa qualidade; a "pressão" consistia na má implementação das práticas de produção, na invasão de áreas protegidas e reservas ecológicas e na redução das fronteiras entre as áreas rurais e urbanas; o "estado" se baseava na contaminação do solo e nas fontes de água e na deficiência no manejo dos excrementos; a "exposição" foi devido à entrada de oocistos pela via fecal-oral, devido à contaminação do solo e da água, e o "efeito" consistiu em diarréia autolimitada, desidratação grave, síndrome de má absorção e morte. CONCLUSÕES Os ecossistemas podem manter populações saudáveis, mas quando são mal gerenciados ou rapidamente alterados devido à pressão humana, também podem ser associados ao aparecimento de doenças, como a criptosporidiose.(AU)

Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em carnívoros silvestres do Estado do Pará Brasil / Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in wild carnivorous animalsthe State of Pará – Brazil

O presente estudo investigou a ocorrência de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em diferentes espécimes silvestres da ordem Carnívora de vida livre e de cativeiro procedentes de municípios do Estado do Pará. Coletou-se amostras fecais de 37 animais distintos (quatro de vida livre e 33 de cativeiro). Para pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. foram utilizados métodos microscópicos (direto e Kinyoun) e imunológico (RIDA®QUICK Cryptosporidium/Giardia/Entamoeba Combi - N1722). Do total de amostras, 24,32% (9/37) foram positivas, correspondendo a 5,4% (2/37) para Cryptosporidium spp. e 18,91% (7/37) para Giardia spp., respectivamente. Nenhum animal apresentou infecção concomitante para os agentes. Cryptosporidium spp. e Giardia spp., são protozoários zoonóticos que representam um emergente problema de saúde pública. Esses parasitos podem apresentar elevada frequência em regiões em que as condições de saneamento básico são precárias, promovendo surtos de diarreia em animais domésticos, silvestres e no homen. Mamíferos silvestres, como os carnívoros, são susceptíveis à contaminação por enteroparasitas presentes tanto no habitat natural como em cativeiro. Portanto, a pesquisa comprova a presença desses protozoários em carnívoros silvestres, tanto mantidos em criatórios como nos de vida livre no Estado do Pará, considerando-se que esses animais podem atuar como fontes de infecção para o homem, para outros animais e para o meio ambiente.

The present survey has had the purpose to investigate the occurrence of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in free and under captivity carnivorous wild animals, from several counties in the State of Pará. Samples of feces from 37 distinct animals (four in their natural habitat and 33 raised in captivity). For the research of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. microscopic immunological, direct and Kinyoun methods were used (RIDA®QUICK Cryptosporidium/Giardia/Entamoeba Combi - N1722). The samples gathered from wild animals have resulted in 24,32% of positive infection on the rate of (9/37), being. 5,4% (2/37) positive to Cryptosporidium spp. and 18,91% (7/37) positive to Giardia spp., what shows that no animals had both infections at the same time. Cryptosporidium spp. and Giardia spp., are zoonotic enteroparasites that have been taking place as an emerging problem to public health. These species of protozoa may reach high levels of frequency in regions where the basic sanitation conditions are precarious, promoting outbreaks of diarrhea to men, wild and domestic animals. Wild mammals, as the carnivorous, are susceptible to contamination by enteroparasites, being present at their natural habitat or captivity. So, the research strengthens the real presence of these protozoas in wild carnivorous in both conditions of life, free or under captivity, in the State of Pará, making us consider the possibility that the cited animals may be natural reservoirs for infections, not only to men but to other animals and also to environment.

Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em carnívoros silvestres do Estado do Pará ­ Brasil / Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in wild carnivorous animals the State of Pará ­ Brazil

O presente estudo investigou a ocorrência de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em diferentes espécimes silvestres da ordem Carnívora de vida livre e de cativeiro procedentes de municípios do Estado do Pará. Coletou-se amostras fecais de 37 animais distintos (quatro de vida livre e 33 de cativeiro). Para pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. foram utilizados métodos microscópicos (direto e Kinyoun) e imunológico (RIDA®QUICK Cryptosporidium/Giardia/Entamoeba Combi - N1722). Do total de amostras, 24,32% (9/37) foram positivas, correspondendo a 5,4% (2/37) para Cryptosporidium spp. e 18,91% (7/37) para Giardia spp., respectivamente. Nenhum animal apresentou infecção concomitante para os agentes. Cryptosporidium spp. e Giardia spp., são protozoários zoonóticos que representam um emergente problema de saúde pública. Esses parasitos podem apresentar elevada frequência em regiões em que as condições de saneamento básico são precárias, promovendo surtos de diarreia em animais domésticos, silvestres e no homen. Mamíferos silvestres, como os carnívoros, são susceptíveis à contaminação por enteroparasitas presentes tanto no habitat natural como em cativeiro. Portanto, a pesquisa comprova a presença desses protozoários em carnívoros silvestres, tanto mantidos em criatórios como nos de vida livre no Estado do Pará, considerando-se que esses animais podem atuar como fontes de infecção para o homem, para outros animais e para o meio ambiente.

The presente survey has had the purpose to investigate the occurrance of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. in free and under captivity carnivorous wild animals, from several counties in the State of Pará. Samples of feces from 37 distinct animals (four in their natural habitat and 33 raised in captivity). For the research of Cryptosporidium spp. and Giardia spp. microscopic immunological, direct and Kinyoun methods were used (RIDA®QUICK Cryptosporidium/Giardia/Entamoeba Combi - N1722). The samples gathered from wild animals have resulted in 24,32% of positive infecction on the rate of (9/37), being. 5,4% (2/37) positive to Cryptosporidiumspp. and 18,91% (7/37) positive to Giardia spp., what shows that no amimals had both infections at the same time. Cryptosporidium spp. and Giardia spp., are zoonotic enteroparasites that have been taking place as an emmerging problem to public health. Theese species of protozoa may reach high levels of frequency in regions where the basic sanitation conditions are precarious, promoting outbraks of diarrhea to men, wild and domestic animals. Wild mammals, as the carnivorous, are susceptible to contamination by enteroparasites, being present at their natural habitat or captivity. So, the reserach strenghtens the real presence of these protozoas in wild carnivorous in both conditions of life, free or under captivity, in the State of Pará, making us consider the possibility that the cited animals may be natural reservoirs for infections, not only to men but to other animals and also to environment.

First study of Cryptosporidium spp. occurrence in eared doves (Zenaida auriculata) / Primeiro estudo de ocorrência de Cryptosporidium spp. em pomba-de-bando (Zenaida auriculata)

Abstract Cryptosporidium is a protozoan parasite with a wide range of hosts, including humans. However, only a few Cryptosporidium species have been described in birds (C. meleagridis, C. baileyi, C. galli and C. avium). The aim of this study was to investigate the occurrence of Cryptosporidium spp. in feces of eared doves (Zenaida auriculata), followed by molecular characterization of the parasite. A total of 196 animals of both sexes were trap-captured; the animals were culled and the intestinal contents were collected for DNA extraction. After extraction, a nested-PCR (nPCR), which amplifies a fragment of the 18S rRNA gene of Cryptosporidium spp., was performed. The amplicons obtained were purified and sequenced. PCR analysis revealed that 30 animals (15.3%) were positive for Cryptosporidium spp. There was no significant sex-dependent enrichment of Cryptosporidium occurrence (p > 0.05). Only 15 out of the 30 positive samples were successfully sequenced and their species determined, of which, 13 (86.7%) and 2 (13.3%) were C. meleagridis and C. galli, respectively. Herein, we present for the first time a molecular characterization of Cryptosporidium from feces of eared doves (Z. auriculata) and propose that these birds are a potential source of C. meleagridis infection in humans.

Resumo Cryptosporidium é um protozoário com uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os seres humanos. No entanto, poucas espécies têm sido descritas em aves (Cryptosporidium meleagridis, C. baileyi, C. galli e C. avium). O objetivo do presente estudo foi investigar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em fezes de pombas-de-bando (Zenaida auriculata), e realizar a caracterização molecular dos isolados. Um total de 196 animais de ambos os sexos foram capturados, eutanasiados e o conteúdo intestinal recolhido para extração de DNA. Após a extração, realizou-se uma nested-PCR (nPCR), que amplifica um fragmento do gene 18S rRNA do Cryptosporidium spp.. Os fragmentos obtidos foram purificados e encaminhados para sequenciamento. Os resultados da n-PCR revelaram 30 animais (15.3%) positivos para Cryptosporidium spp.. Quanto ao sexo dos animais não foram observadas diferenças estatísticas significativas (p > 0.05). Somente 15 de 30 amostras positivas foram sequenciadas com sucesso e as espécies determinadas, das quais, 13 (86.7%) e 2 (13.3%) foram C. meleagridis e C. galli, respectivamente. Esse é o primeiro estudo com caracterização molecular de Cryptosporidium de fezes de pombas-de-bando (Z. auriculata), e propõe serem esses animais potenciais fonte de infecção de C. meleagridis para humanos.

Risk factors and infection due to Cryptosporidium spp. in dogs and cats in southern Rio Grande do Sul / Fatores de risco e infecção por Cryptosporidium spp. em cães e gatos no sul do Rio Grande do Sul

Abstract This study investigated the frequency of oocysts of Cryptosporidium spp. in feces from dogs and cats in five municipalities in the southern region of the state of Rio Grande do Sul. The risk factors associated with infection were also investigated. Feces samples from 110 dogs and 18 cats were stained using the auramine method. At the time of feces sampling, a questionnaire with semi-open-ended questions was applied to the animal guardians and all data obtained underwent statistical analysis. The real frequency of oocysts of Cryptosporidium spp. was 24.63% (27 dogs and two cats). Only four samples of dog feces were diarrheic and no presence of oocysts was observed in any of them. Variables that represented risk factors for infection were: homemade food, untreated water, circulation of animals on grassy terrain and living in the same environment as other animals (cattle). The results made it possible to inferring that within the population studied, the frequency of parasitism due to Cryptosporidium spp. in dogs was relevant and emphasize the asymptomatic nature of this infection. The adopting control measures are highlighted, particularly in relation to variables that represent risk factors for this infection.

Resumo Este estudo verificou a frequência de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de cães e gatos em cinco municípios da região sul do Rio Grande do Sul e fatores de risco associados à infecção. Amostras de fezes de 110 cães e 18 gatos foram coradas pelo método de auramina. No momento da coleta de fezes aplicou-se um questionário aos tutores dos animais com questões semiabertas e os dados foram submetidos à análise estatística. A frequência verdadeira de oocistos de Cryptosporidium spp. foi de 24,63% (27 cães e 2 gatos). Apenas quatro amostras de fezes caninas eram diarreicas e todas sem oocistos. As variáveis que representaram fatores de risco para a infecção foram: alimentos de preparo caseiro, água não tratada, circulação dos animais em terreno gramíneo e convivência com outros animais, principalmente bovinos. Os resultados sugerem que a frequência de cães parasitados por Cryptosporidium spp. é relevante, reforçando o caráter assintomático da infeção. Destaca-se a importância da adoção de medidas de controle, particularmente das variáveis que representaram fatores de risco à infecção.

Detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) using different diagnostic methods / Detecção e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em canários mantidos em cativeiro (Serinus canaria) por diferentes métodos de diagnóstico

Abstract This study used several diagnostic methods to examine the occurrence of and molecularly characterize Cryptosporidium spp. in captive canaries (Serinus canaria) in southern and southeastern Brazil. A total of 498 fecal samples were purified by centrifugal-flotation using Sheather's solution. Cryptosporidium spp. diagnosis was performed using three diagnostic methods: malachite green negative staining, nested PCR targeting the 18S rRNA gene, followed by sequencing the amplified fragments, and duplex real-time PCR targeting the 18S rRNA specific to detect Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III. The overall positivity for Cryptosporidium spp. (total samples positive in at least one protocol) from the microscopic analysis, nested PCR and duplex real-time PCR protocol results was 13.3% (66/498). The positivity rates were 2.0% (10/498) and 4.6% (23/498) for Cryptosporidium spp. by microscopy and nested PCR, respectively. Sequencing of 20 samples amplified by nested PCR identified C. galli (3.0%; 15/498), Cryptosporidium avian genotype I (0.8%; 4/498) and Cryptosporidium avium (0.2%; 1/498). Duplex real-time PCR revealed a positivity of 7.8% (39/498) for C. galli and 2.4% (12/498) for avian genotype III. Malachite green negative staining differed significantly from nested PCR in detecting Cryptosporidium spp. Duplex real-time PCR was more sensitive than nested PCR/sequencing for detecting gastric Cryptosporidium in canaries.

Resumo Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência e realizar a caracterização molecular de Cryptosporidium spp. em 498 amostras fecais de canários (Serinus canaria) criados em cativeiro, utilizando três métodos de diagnóstico: análise microscópica pela coloração negativa com verde malaquita, nested PCR seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados e PCR duplex em tempo real específica para detecção de Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves. A positividade total para Cryptosporidium spp. (total de amostras positivas em pelo menos um método de diagnóstico) obtida pela análise microscópica, nested PCR e PCR duplex em tempo real foi de 13,3% (66/498). As taxas de positividade para Cryptosporidium spp. foram 2,0% (10/498) e 4,6% (23/498) por microscopia e nested PCR, respectivamente. O sequenciamento de 20 amostras amplificadas pela nested PCR identificou C. galli (3,0%; 15/498), Cryptosporidium genótipo I de aves (0,8%; 4/498) e Cryptosporidium avium (0,2%; 1/498). A PCR duplex em tempo real revelou positividade de 7,8% (39/498) para C. galli e 2,4% (12/498) para Cryptosporidium genótipo III de aves. A análise microscópica diferiu significativamente da nested PCR para detecção de Cryptosporidium spp. A PCR duplex em tempo real apresentou maior sensibilidade que a nested PCR/sequenciamento para detectar as espécies/genótipos gástricos de Cryptosporidium.

Ocorrência de Cryptosporidium spp. em bezerros bubalinos no estado do Pará / Occurrence of Cryptosporidium spp. in calves buffaloes in the state of Pará

A criptosporidiose é uma zoonose causada por protozoários do gênero Cryptosporidium, que acomete diversas espécies animais, inclusive o homem. Com o presente estudo objetivou-se determinar a ocorrência da infecção por Cryptosporidium spp. em bubalinos criados no estado do Pará. Para tanto, foram colhidas fezes de 253 bubalinos, de um dia até seis meses de idade. As fezes colhidas diretamente do reto foram classificadas como diarreicas e não diarreicas segundo a consistência e o aspecto, e analisadas em microscópio óptico após procedimentos de centrifugação, concentração e coloração pelo corante de Kinyoun. Observou-se uma ocorrência de Cryptosporidium spp. em 2,37% (6/253) das amostras, sendo todas não diarreicas. Não foi estabelecida relação significativa entre a infecção por Cryptosporidium spp., os sinais clínicos de diarreia e a idade dos animais (p > 0,05). Deste modo, conclui-se que a infecção pelo protozoário Cryptosporidium spp. em bubalinos no estado do Pará apresenta uma baixa ocorrência em animais na faixa etária de um dia até seis meses de idade.(AU)

Cryptosporidiosis is a zoonosis caused by opportunistic protozoa of the genus Cryptosporidium spp. that attacks various animal species, including humans. This study had the objective of determining the occurrence of infection by Cryptosporidium spp. in buffalo raised in the state of Pará, Brazil, and establishing the relations between Cryptosporidium spp., the age of the animal and the presence of clinical signs of diarrhea. A total of 253 samples of feces from one day to 6-month old buffalo were analyzed. The fecal samples, collected directly from the rectum, were classified as diarrheal and non-diarrheal and analyzed with an optical microscope after centrifuge-concentration and staining with Kinyoun stain. Laboratory analysis revealed the presence of Cryptosporidium spp. in 2.37% (6/253) samples, all of which had a firm consistency. No significant relation was established between infection by Cryptosporidium spp., the animals age from one day to 6-month and clinical symptoms of diarrhea.(AU)

Surto de criptosporidiose em bezerros no Sul do Rio Grande do Sul / Outbreak of cryptosporidiosis in calves in Southern Brazil

Descrevem-se os aspectos epidemiológicos, sinais clínicos e a patologia de um surto de criptosporidiose em bezerros na região Sul do Rio Grande do Sul. De um lote de 400 bezerros de 30-45 dias de idade, 35 adoeceram e 16 morreram. Os bezerros nasciam fracos e logo após o nascimento apresentavam diarreia amarela, emagrecimento progressivo, desidratação, depressão e morte entre 10 e 15 dias após o início dos sinais clínicos. Na necropsia havia congestão dos vasos sanguíneos intestinais e mesentéricos. Havia distensão intestinal por gás e dilatação de vasos linfáticos. Microscopicamente havia achatamento das vilosidades intestinais, com necrose e atrofia. Aderidas à superfície das células epiteliais das vilosidades, havia estruturas puntiformes basofílicas de 2-5µm de diâmetro compatíveis com Cryptosporidium spp. A microscopia eletrônica revelou a presença de diferentes estágios do agente aderidos às microvilosidades de enterócitos. Alerta-se para a importância da criptosporidiose como agente primário de diarreia em bezerros. São necessárias medidas preventivas no que se refere ao manejo para diminuir as perdas econômicas e a contaminação ambiental, e, ainda, diminuir o risco para a saúde pública...

This paper describes the epidemiology, clinical signs and pathology of an outbreak of cryptosporidiosis in calves in Southern Brazil. Thirty-five out of 400 calves with 30-45 days of age were affected and 16 died. The calves were born weak and just after birth they had yellow diarrhea, weight loss, dehydration, depression, and death between 10 and 15 days after onset of clinical signs. Congestion of the bowel and mesenteric blood vessels were observed at necropsy. Intestinal distension by gas and dilation of lymphatic vessels were also observed. Microscopically, the intestine showed flattening of the villi with necrosis and atrophy. Adhered to the surface of the villus epithelial cells there were round basophilic structures of 2- to 5-μm-diameter compatible with Cryptosporidium spp. Electron microscopy revealed the presence of different stages of the agent adhered to the microvilli of enterocytes. We alert the importance of cryptosporidiosis as a primary agent of diarrhea in calves. Preventive measures to reduce economic losses, environmental contamination, and also decrease of risk for public health are necessary...

Occurrence of Cryptosporidum sp in sinantropic Rattus (fischer, 1803) and Mus (linnaeus, 1758) captured in the urban area of umuarama, pr, Brazil / Ocorrência de Cryptosporidum sp em sinantropic Rattus (fischer, 1803) E Mus linnaeus, 1758) capturado na área urbana de Umuarama, PR, Brasil / Ocurrencia de Cryptosporidum sp en sinantropic Rattus (Fischer, 1803) Y Mus (linnaeus 1758) capturado en la zona urbana de umuarama, paraná, Brasil

ABSTRACT: Sinantropic rodents, mainly of the genus Rattus and Mus, can be used as indicators of environmental contamination by Cryptosporidium oocysts, responsible for high rates of infection in humans and animals, and for economic losses and poor health of individuals. In this work, in order to measure the frequency of Cryptosporidium in rodents in the urban area of Umuarama, PR, fecal samples of these animals were collected and analyzed using the Kinyoun staining method to determine the absolute and relative frequency of the parasite. From 50 samples collected, 26 showed rounded reddish structures, with the presence of parasitic forms inside, compatible with oocysts of Cryptosporidium sp. Higher frequency (P-value <0.05) is found in Rattus, with no difference between sexes and origin of animals. The measurement of oocysts suggests the occurrence of zoonotic species Criptosporidium parvum.

Os roedores sinantrópicos, principalmente dos gêneros Rattus e Mus, podem servir como indicadores da contaminação ambiental por oocistos de Cryptosporidium, parasito celular obrigatório, responsável por elevadas taxas de infecção no ser humano, e animais, e por perdas econômicas, e na saúde dos indivíduos. Neste trabalho, verificou-se a frequência de Cryptosporidium em roedores na área urbana de Umuarama, PR. Para tanto, foram coletadas amostras fecais dos roedores, que foram analisadas pelo método de Kinyoun, determinando a frequência absoluta e relativa do parasito. Das 50 amostras coletadas, 26% apresentaram estruturas arredondadas, com presença de formas parasitárias em seu interior e coloração avermelhada, compatíveis com oocistos de Cryptosporidium sp. Maior frequência (P>0.05) foi encontrada em Rattus sem diferença entre os sexos e a origem dos animais. A mensuração dos oocistos sugere a ocorrência da espécie zoonótica Criptosporidium parvum.

Roedores sinantrópicos, principalmente del género Rattus y Mus, pueden servir como indicadores de contaminación ambiental por ooquistes de Cryptosporidium, parásito celular obligatorio, responsable por altas tasas de infección en el ser humano y animales, y para la salud de las personas y pérdidas económicas. En este estudio se verificó la frecuencia de Cryptosporidium en roedores de la zona urbana de Umuarama, PR. Fueron recogidas muestras de heces de los roedores, que fueron analizadas por el método Kinyoun, determinándose la frecuencia absoluta y relativa del parásito. De las 50 muestras recolectadas, 26% presentaban estructuras redondeadas, con presencia de formas parasitarias en su interior y coloración rojiza, compatibles con ooquistes de Cryptosporidium sp. Mayor frecuencia (P<0.05) se encontró en Rattus, sin diferencia entre los sexos y el origen de los animales. La medición de los ooquistes sugiere la ocurrencia de la especie zoonótica Cryptosporidium parvum.

Prevalência de Cryptosporidium serpentis em serpentes de cativeiro / Prevalence of Cryptosporidium serpentis in captive snakes

Cryptosporidium é um protozoário encontrado em uma grande variedade de espécies animais como responsável por casos de gastrite e enterite, porém com epidemiologia pouco conhecida em animais silvestres. A presente investigação teve como objetivo avaliar a prevalência de Cryptosporidium serpentis em lavado gástrico de serpentes mantidas em cativeiro no serpentário do Instituto Butantan (São Paulo, Brasil). A coleta foi realizada uma semana após alimentação, evitando, assim, a regurgitação devido à manipulação. Foram realizados esfregaços do sedimento do lavado gástrico, obtido por centrifugação, corados pela técnica de coloração de Kinyoun. Parte do sedimento foi submetido à técnica de RFLP-PCR para identificação da espécie de Cryptosporidium. O serpentário é dividido em três seções, por espécie - a primeira com oito jibóias (Boa constrictor amarali), a segunda com dez jararacas (Bothropoides jararaca) e a última com sete cascavéis (Caudisona durissa). A prevalência de C. serpentis encontrada neste estudo para as serpentes C. durissa, B. jararaca e Boa c. amarali, foi de 57,14 por cento (04/07), 40 por cento (04/10) e 37,5 por cento (03/08), respectivamente, revelando importante ocorrência desse protozoário em serpentes de cativeiro. Apesar da alta prevalência encontrada, apenas as jiboias apresentaram sintomas como perda de peso e regurgitação, refletindo uma sensibilidade diferente da espécie para C. serpentis.

Cryptosporidium is a protozoan found in a wide variety of animal species which is responsible for gastritis and enteritis, but its epidemiology is poorly known in wild animals. The present investigation aimed to evaluate the prevalence of Cryptosporidium serpentis in gastric aspirate of captive snakes from the public serpentarium of the Butantan Institute (São Paulo, Brazil). Sampling was performed preferably one week after feeding, thereby preventing regurgitation due to manipulation. Smears were done from the gastric aspirate sediment obtained by centrifugation and stained by Kinyoun technique. Part of the pellet was submitted to RFLP-PCR technique for amplification of Cryptosporidium segment (833bp, CSP01) of SSU rRNA gene. The serpentarium was divided in three sections by species - the first housing eight Amaral´s Boa (Boa constrictor amarali), the second with ten jararacas (Bothropoides jararaca) and the last one with seven south american rattlesnakes (Caudisona durissa). The prevalence of C. serpentis found in this study for the snakes C. durissa, B. jararaca and B. constrictor was 57.14 percent (04/07), 40 percent (04/10) and 37.5 percent (03/08), respectively, thus revealing the high occurrence of this protozoan among captive snakes. Despite the high prevalence found, only B. constrictor amarali presented symptoms as regurgitation and weight loss, probably due to a different sensibility of this species to C. serpentis.

Risk factors associated with the occurrence of Cryptosporidium parvum infection in calves / Fatores de risco associados à ocorrência de infecção por Cryptosporidium parvum em bezerros

Cryptosporidium parvum oocysts were detected in feces of dairy calves raised in Rio de Janeiro State and the risk factors involved in the infection were determined. A hundred calves aging up to 12-month-old from 13 dairy farms were sampled. Polymerase chain reaction was used to detect the presence of oocysts. The zoonotic C. parvum species was detected in 45 percent animals. Statistical risk factors analyses revealed an association between infection and animals raised in technical systems such as the use of milking equipment, milking cooler, and water trough(P<0.05).

Detectaram-se oocistos de Cryptosporidium parvum em fezes de bezerros leiteiros no estado do Rio de Janeiro e analisaram-se os fatores de risco envolvidos na infecção dos animais. Cem bezerros com idades de 0 a 12 meses, provenientes de 13 propriedades rurais, foram amostrados, e suas fezes examinadas pela reação em cadeia da polimerase para a detecção dos oocistos. A espécie zoonótica C. parvum foi detectada em 45 por cento dos animais. As análises estatísticas dos fatores de risco revelaram haver associação entre infecção e animais criados em propriedades tecnificadas, que usam ordenha mecanizada, resfriamento de leite e fazendas que continham reservatórios de água à disposição dos animais (P<0,05).

Occurrence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. isolated from domestic animals in a rural area surrounding Atlantic dry forest fragments in Teodoro Sampaio municipality, State of São Paulo, Brazil / Ocorrência e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. isolados de animais domésticos de propriedades rurais circunvizinhas a fragmentos de Floresta Atlântica Seca do Estado de São Paulo, Brasil

The aim of this study was to assess the occurrence of Cryptosporidium in domestic animals in rural properties surrounding rain forest fragments within the municipality of Teodoro Sampaio, southeastern Brazil. Conventional sucrose flotation method followed by molecular characterization of the parasites by sequencing PCR products amplified from SSU rRNA gene were used. Stool samples were collected from domestic animals raised as pets and livestock in all rural properties surrounding three forest fragments. Samples from cattle (197), equine (63), pigs (25), sheep (11), and dogs (28) were collected from 98 rural properties. The frequency of occurrence of Cryptosporidium within each animal species was 3.0 percent (6/197) among cattle and 10.7 percent (3/28) among dogs. Cryptosporidium was not detected in stool samples from equine, sheep, and pigs. All sequences obtained from the six samples of calves showed molecular identity with Cryptosporidium andersoni while all sequences from dog samples were similar to C. canis. The frequency of occurrence of Cryptosporidium in these domestic animal species was low. The absence of C. parvum in the present study suggests that the zoonotic cycle of cryptosporidiosis may not be relevant in the region studied. The presence of Cryptosporidium species seldom described in humans may be, otherwise, important for the wild fauna as these animals are a source of infection and dissemination of this protozoan to other animal species. The impact and magnitude of infection by C. andersoni in wild ruminants and C. canis in wild canids have to be assessed in future studies to better understand the actual importance of these species in this region.

O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de Cryptosporidium, em animais domésticos de propriedades rurais ao redor de fragmentos de mata Atlântica de interior no município de Teodoro Sampaio, por exame convencional de flutuação em solução de sacarose, seguido de caracterização molecular dos parasitas através do sequenciamento dos produtos amplificados na PCR do gene SSU rRNA. Foram coletadas amostras fecais de animais domésticos criados para subsistência e estimação nas propriedades rurais do entorno de três fragmentos florestais. Amostras de bovinos (197), equinos (63), suínos (25), ovinos (11) e cães (28) foram coletadas de 98 propriedades rurais. A ocorrência de Cryptosporidium para a espécie bovina foi de 3,0 por cento (6/197); para os cães, de 10,7 por cento (3/28); e para os demais animais os resultados foram negativos. Todas as sequências obtidas das seis amostras de bovinos apresentaram identidade molecular com Cryptosporidium andersoni, enquanto as sequências oriundas de amostras de fezes de cães revelaram-se similares ao C. canis. A ocorrência do Cryptosporidium entre os animais estudados foi baixa. Diante dos resultados do presente estudo, o ciclo zoonótico da criptosporidiose parece ter menos importância nesta região. A presença de espécies de Cryptosporidium ainda pouco relatadas em humanos pode ser, por outro lado, importante para a fauna silvestre, uma vez que estes animais podem ser considerados como uma fonte de infecção e disseminação deste protozoário. O impacto e a magnitude da infecção de C. andersoni, em ruminantes selvagens, e de C. canis, em cães silvestres, deve ser avaliado em estudos futuros, com intuito de verificar a real importância dessas espécies nesta região.

Criptosporidiose em paciente com espondilite anquilosante usando adalimumabe / Cryptosporidiosis in a patient with ankylosing spondylitis treated with adalimumab

A criptosporidiose é uma doença parasitária causada pelo protozoário Cryptosporidium sp. Observou-se um aumento no número de diagnósticos realizados nos últimos vinte anos, principalmente em pacientes que apresentam imunodeficiências como a síndrome da imunodeficiência humana adquirida e as imunodeficiências induzidas como em pacientes transplantados e nos que necessitam realizar hemodiálise frequentemente. Relata-se o caso de um jovem com espondilite anquilosante que, usando adalimumabe, apresentou diarreia devido à criptosporidiose.

Cryptosporidiosis is a parasitic disease caused by a protozoan called Cryptosporidium sp. An increased number of diagnoses were made in the last 20 years, especially in patients with immunodeficiency like the acquired human immunodeficiency syndrome and induced immunodeficiency, such as in transplant patients and those who need frequent hemodialysis, has been observed. We report the case of a young patient with ankylosing spondylitis treated with adalimumab who developed chronic diarrhea secondary to cryptosporidiosis.

Importância de Cryptosporidium spp. como causa de diarréia em bezerros / Importance of Cryptosporidium spp. as a cause of diarrhea in calves

Avaliou-se a presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras de fezes de 14 bezerros e de suas mães até a oitava semana pós parição. A maior taxa de excreção de oocistos foi verificada em bezerros com sete dias de idade. Das vacas, 42,8 por cento foram positivas para Cryptosporidium no período pós-parto. Em outra etapa deste estudo, foram acompanhados 57 bezerros positivos para Cryptosporidium, com até 30 dias de idade, provenientes de 32 propriedades leiteiras, e estudouse o grau de eliminação dos oocistos com a possível ocorrência de diarréia. Em todos os animais positivos para Cryptosporidium foi pesquisada a presença de bactérias enteropatogênicas, vírus (Rotavirus e Coronavirus) e protozoários (Eimeria spp.).(AU)

The aim of this research was to evaluate the shedding of Cryptosporidium spp. oocysts in fecal samples from 14 calves from one dairy farm, from birth until 60 days old and from cows until eight weeks after parturition. The higher percentage of oocysts excreted was observed in 7-day-old calves. In the post-partum period 43.7 percent of cows were positive for Cryptosporidium oocysts. Further analyses were accomplished in 57 calves from another 32 milk farms, previously known as positive for Cryptosporidium, through oocysts fecal screening and clinical signs analyses until calves were 30 days old. Fecal samples from all animals that presented diarrhea were screened for the presence of bacteria, virus (Rotavirus and Coronavirus ) and protozoa (Eimeria spp.).(AU)

Ocorrência de Cryptosporidium sp em fezes diarréicas de crianças do Município de Maringá - PR / Occurence of Cryptosporidium sp in diarrheic feces of children living in Maringá - PR

Com o objetivo de se investigar a freqüência de infecção por Cryptosporidium sp examinaram-se 136 amostras de fezes diarréicas de crianças, com idade de zero a 12 anos, internadas no Hospital Universitário Regional de Maringá (HURM) e encaminhadas ao Núcleo Integrado de Saúde III (NIS III), Oocistos de Cryptosporidium sp foram encontrados em 9 (6,6%) amostras fecais, após prévia concentração do material pela técnica de sedimentação em formol-éter e posterior coloração dos esfregaços pela carbol fucsina associada ao demetisulfóxido. Prevalência maiores de infecção por Cryptosporidium sp foram observadas entre as crianças de faixa etária igual ou superior a 1 ano e inferior a 2 anos de idade. Ovos de helmintos ou cistos de protozoários pesquisados através da técnica de sedimentação em formol-éter foram detectados em 16,2% das amostras. Nenhuma das amostras positivas para Cryptosporidium sp foi positiva para outros protozoários ou helmintos intestinais. Vale ressaltar que a exceção da espécie Giárdia duodenalis, cuja prevalência ofi de 10,3%, a ocorrências de Cryptosporidium sp foi superior a(6,6%) a observada para outros protozoários ou helmintos intestinais.