Comparison of techniques for corneal epithelium cell culture for the collection of conditioned medium / Comparação das técnicas de cultivo de células epiteliais da córnea para a coleta de meio condicionado

ABSTRACT Purposes: To determine the best protocol in obtaining the higher yield of conditioned culture medium to be used for the bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into corneal epithelial cells, five techniques for the primary culture of human corneal epithelial cells were evaluated. Methods: The studied culture techniques of corneal epithelial cells were: explants in culture flasks with and without hydrophilic surface treatment, on amniotic membrane, with enzymatic digestion, and by corneal scraping. The conditioned culture medium collected from these cultures was used to differentiate human bone marrow mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells, which were characterized using flow cytometry with pan-cytokeratin and the corneal-specific markers, cytokeratin 3 and cytokeratin 12. Results: The culture technique using flasks with hydrophilic surface treatment resulted in the highest yield of conditioned culture medium. Flasks without surface treatment resulted to a very low success rate. Enzymatic digestion and corneal scraping showed contamination with corneal fibroblasts. The culture on amniotic membranes only allowed the collection of culture medium during the 1st cell confluence. The effectiveness of cell differentiation was confirmed by cytometry analysis using the collected conditioned culture medium, as demonstrated by the expressions of cytokeratin 3 (95.3%), cytokeratin 12 (93.4%), and pan-cytokeratin (95.3%). Conclusion: The culture of corneal epithelial cell explants in flasks with hydrophilic surface treatment is the best technique for collecting a higher yield of conditioned culture medium to be used to differentiate mesenchymal stem cells.

RESUMO Objetivos: Foram estudadas cinco técnicas de cultivo primário de células epiteliais de córnea humana para se determinar o melhor protocolo para a obtenção do maior rendimento de meio de cultivo condicionado para ser utilizado na diferenciação de células tronco mesenquimais para células epiteliais de córnea. Métodos: As técnicas de cultivo estudadas foram: explantes em frascos de cultivo com e sem tratamento hidrofílico de superfície, sobre membrana amniótica, com digestão enzimática e por raspado de córnea. O meio de cultivo condicionado foi coletado e as células tronco mesenquimais induzidas a se diferenciarem em células epiteliais da córnea utilizando o meio de cultivo condicionado. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo com pan-citoqueratina e com os marcadores específicos da córnea, citoqueratina 3 e citoqueratina 12. Resultados: A técnica utilizando frascos com o tratamento de superfície apresentou o maior rendimento de meio de cultivo condicionado. Os frascos sem tratamento de superfície levaram a uma taxa de sucesso muito baixa. A digestão enzimática e a raspagem da córnea mostraram contaminação das culturas com fibroblastos de córnea. A cultura sobre membranas amnióticas só permitiu a coleta do meio de cultivo condicionado durante a 1ª confluência celular. A análise de citometria de fluxo confirmou o sucesso da diferenciação celular utilizando o meio de cultivo condicionado coletado, demonstrada pela expressão de citoqueratina 3 (95,3%), citoqueratina 12 (93,4%) e pan-citoqueratina (95,3%). Conclusão: O cultivo de explantes de células tronco mesenquimais em frascos com tratamento hidrofílico de superfície é a melhor técnica para a obtenção de um alto rendimento de meio de cultivo condicionado.

Efecto de la intensidad de las unidades de fotopolimerización sobre la biocompatibilidad y resistencia a la flexión de una resina compuesta

Objetivo: Determinar el efecto de la intensidad de dos unidades de fotopolimerización sobre la biocompatibilidad, resistencia flexural y módulo elástico de una resina compuesta. Metodología: Se crearon dos grupos de resina compuesta Filtek Z250XT cada uno fotopolimerizado con intensidades diferentes (800 mW/cm2 por 20s). La viabilidad celular fue analizada mediante ensayo de MTT a las 24 y 48 horas siguiendo la normativa ISO 10993-5. La resistencia flexural y módulo elástico fueron analizadas siguiendo la normativa ISO 4049. Resultados: En el grupo fotopolimerizado con una intensidad <400 mW/cm2, la citotoxicidad fue estadísticamente mayor tanto a las 24 como a las 48 horas y la resistencia flexural y módulo elástico fueron estadísticamente menores Conclusión: Una intensidad de polimerización <400 mW/cm2, aumenta los niveles de citotoxicidad y disminuye las propiedades mecánicas de las resinas compuestas. Se destaca la importancia del control periódico de las unidades de fotopolimerización.

Objetivo: Determinar o efeito da intensidade de duas unidades de fotopolimerização na biocompatibilidade, resistência à flexão e módulo de elasticidade de uma resina composta. Metodologia: Foram fabricados dois grupos de resina composta Filtek Z250XT, cada um deles foi fotopolimerizado com intensidades diferentes ( 800 mW/cm2 por 20s). A viabilidade celular foi analisada por ensaio de MTT em 24 e 48 horas seguindo a norma ISO 10993-5. A resistência à flexão e o módulo de elasticidade foram analisados ​​seguindo a norma ISO 4049. Resultados: No grupo fotopolimerizado com intensidade <400mW/cm2, a citotoxicidade foi estatisticamente maior nas 24 e 48 horas e a resistência à flexão e o módulo de elasticidade foram estatisticamente menores. Conclusão: Uma intensidade de polimerização <400 mW/cm2 aumenta os níveis de citotoxicidade e diminui as propriedades mecânicas das resinas compostas. Destaca-se a importância do controle periódico das unidades de fotopolimerização.

Objective: To determine the effect of the intensity of two light curing units on the biocompatibility, flexural strength and elastic modulus of a composite resin. Methodology: Two groups of Filtek Z250XT (3M ESPE) composite resin were created, each one photopolymerized using different intensities ( 800 mW/cm2 for 20s). Cell viability was analyzed by MTT assay at 24 and 48 hours following the ISO 10993-5 standard. The flexural strength and elastic modulus were analyzed following the ISO 4049 standard. Results: In the group photopolymerized with an intensity <400 mW/cm2, cytotoxicity was statistically higher both at 24 and 48 hours and flexural strength and elastic modulus were statistically lower. Conclusion: A polymerization intensity <400 mW/cm2 increases the levels of cytotoxicity and decreases the mechanical properties of composite resins. The importance of the periodic control of the light curing units is emphasized.

Comparison of primary keloid fibroblast cultivation methods and the characteristics of fibroblasts cultured from keloids, keloid-surrounding tissues, and normal skin tissues / Comparación de los métodos de cultivo de fibroblastos queloides primarios y las características de los fibroblastos cultivados a partir de queloides, tejidos circundantes queloides y tejidos cutáneos normales

SUMMARY: The establishment of primary keloid fibroblast culture has always been a fundamental measure for studying mechanisms of keloid disease. The quality of the primary cell culture can directly affect the results of further experiments. This study was performed to investigate the optimal growth conditions, including the optimal storage time and collagenase treatment time, for in vitro cell culture models and the suitable methods for epidermis-dermis separation in different tissues. Keloid tissues, keloid-surrounding tissues, and normal skin tissues were collected from patients, for primary fibroblast culture. Two methods, tissue explant and collagenase digestion, were deployed and compared. Expression levels of the keloid-related genes α -SMA, Col1, and Col3 were assessed in cells cultured using both methods, to verify the qualities of the primary cells. A comparative analysis was conducted between the two methods and among the three different tissues used. Bacterial and lipid contamination was immediately minimized after the samples were processed. Different methods of epidermis removal and different durations of collagenase digestion were required in different tissues to generate optimal results. Real-time PCR results showed that the mRNA expression levels of keloid-related genes in cultured fibroblasts correlated to their in vivo expression profile, as previously reported in other studies. The results of this study have revealed several key points in the culture of primary keloid fibroblasts and demonstrated the correlation in gene expression between in vivo keloid fibroblasts and in vitro primary keloid fibroblasts.

RESUMEN: La identificación de un cultivo de fibroblastos queloides primarios, siempre ha sido una medida fundamental para estudiar los mecanismos de la enfermedad queloide. La calidad del cultivo de células primarias puede afectar directamente los resultados de otros experimentos. Este estudio se realizó para investigar las condiciones óptimas de crecimiento, incluido el tiempo óptimo de almacenamiento y el tiempo de tratamiento con colagenasa, para modelos de cultivo celular in vitro y los métodos adecuados para la separación epidermis-dermis en diferentes tejidos. Se recogieron de los pacientes tejidos queloides, tejidos circundantes queloides y tejidos cutáneos normales, para cultivo primario de fibroblastos. Se implementaron y compararon dos métodos, explante de tejido y digestión con colagenasa. Los niveles de expresión de los genes relacionados con queloides α -SMA, Col1 y Col3 se evaluaron en células cultivadas usando ambos métodos, para verificar las cualidades de las células primarias. Se realizó un análisis comparativo entre los dos métodos y entre los tres tejidos diferentes utilizados. La contaminación de bacterias y lípidos se minimizó inmediatamente después de que se procesaron las muestras. Se requirieron varios métodos de eliminación de la epidermis y diferentes tiempos de digestión con colagenasa en los tejidos para generar resultados óptimos. Los resultados de la PCR en tiempo real mostraron que los niveles de expresión de ARNm de genes relacionados con queloides en fibroblastos cultivados se correlacionaban con su perfil de expresión in vivo, como se informó en estudios anteriores. Los resultados de este studio indicaron varios puntos clave en el cultivo de fibroblastos queloides primarios y han demostrado la correlación en la expresión génica entre fibroblastos queloides in vivo y fibroblastos queloides primarios in vitro.

CARDIAC GLYCOSIDES, PHENOLIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY FROM PLANT CELL SUSPENSION CULTURES OF Thevetia peruviana / PRODUCCIÓN DE GLÍCOSIDOS CARDIOTÓNICOS, COMPUESTOS FENÓLICOS Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN DE Thevetia peruviana

Cell suspension cultures of Thevetia peruviana were established under dark for 19 days to investigate kinetic behavior related to biomass, substrate, cardiac glycoside, polyphenols, reactive oxygen species and anti-oxidant activity. The results showed high biomass production (18.80gDW/L) as well as sucrose consumption in 7 days. Preferential glucose over fructose consumption was observed. Intracellular production of cardiac glycosides reached 2.58mg DE/gDW at day 19. Highest extracellular production was reached between day 2 and 7 (6.19mg DE/L). Highest extracellular phenolic content was 80.61 ± 5.16mg GAE/L at day 7. Intracellular phenolic content increased to 2.76 ± 0.14mg GAE/gFW at day 7 and remained constant until day 19. ROS production at day 7 could be related to sucrose and glucose total consumption. Pearson Product-Moment Correlation Coefficient (ρ) showed that the phenolic compounds in cell suspension cultures of T. peruviana were responsible for the observed anti-oxidant activity. All together, these results give the first steps in metabolic behavior in cell suspension cultures of T. peruviana.

Se establecieron cultivos en suspensión de la especie vegetal Thevetia peruviana en oscuridad, durante 19 días, para estudiar el comportamiento cinético de producción de biomasa, consumo de sustrato, producción de glicósidos cardiotónicos, polifenoles, especies reactivas de oxígeno y actividad antioxidante. Los resultados mostraron una alta producción de biomasa (18,80g PS/L), al igual que consumo total de sacarosa, a los 7 días de cultivo. Se observó un consumo preferencial de glucosa sobre fructosa durante todo el cultivo. La producción de glicósidos cardiotónicos intracelulares alcanzó valores de 2,58mg ED/g PS, al día 19. La mayor producción extracelular (6,19mg ED/L), se alcanzó entre los días 2 y 7. El mayor contenido de compuestos fenólicos extracelular fue de 80,61 ± 5,16mg GAE/L, en el día 7. El contenido de compuestos fenólicos intracelulares incrementó a 2,76 ± 0,14mg AGE/gPF, al día 7 y se mantuvo constante, hasta el día 19. La producción de EROs, al día 7, puede estar relacionada con el consumo total de sacarosa y glucosa. El coeficiente de correlación producto-momento de Pearson (ρ) indicó que los compuestos fenólicos en cultivos celulares en suspensión de T. peruviana eran los responsables de la actividad antioxidante observada. En conjunto, estos resultados brindan las primeras bases relacionadas al comportamiento metabólico de cultivos celulares en suspensión, de T. peruviana.

Efeito da terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura celular de fibroblastos / Efecto del ultrasonido de baja intensidad en cultivo celular de fibroblastos / Effect of low-intensity pulsed ultrasound therapy on a fibroblasts cell culture

Dentro da prática fisioterápica verifica-se a ampla utilização do ultrassom terapêutico para tratamento das diversas afecções musculoesqueléticas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade, com diferentes regimes de pulsos e intensidade, em cultura celular de fibroblastos L929 (ATCC CCL-1 NCTC), de modo a verificar a viabilidade celular e definir parâmetros de dosimetria. Para isso, utilizou-se a aplicação de ultrassom pulsado, com frequência de 1Mhz, em cultura de células fibroblásticas, divididas em cinco grupos (controle e com intensidade instantâneas de 0,3W/cm2-10%; 0,3W/cm2 -20 %; 0,5W/cm2 -10% e US 0,5W/cm2 -20 % - 100Hz). A irradiação ocorreu com intervalos de 24, 48 e 72 horas, por dois minutos, e após 24 horas de cada irradiação foi realizado teste de MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]. Os resultados revelaram que ao compararem-se os valores de células viáveis pelo método MTT nos cinco grupos, não foi possível encontrar diferença estatisticamente significativa em nenhum deles, nos três momentos avaliados (24, 48 e 72 horas); enquanto que, ao se realizar a análise de medida repetida nos diferentes grupos, encontrou-se diferença estatisticamente significativa apenas no grupo irradiado com ultrassom a 0,5W/ cm2com regime de pulso de 10% (p=0,003). Com base nesses resultados, conclui-se que a irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade em cultura celular de fibroblastos L929, somente no grupo com intensidade de 0,5W/cm2-10% obteve o crescimento numérico, com significância estatística em todos os períodos de avaliação.

En la práctica fisioterápica se utiliza bastante el ultrasonido como terapia para el tratamiento de diversos trastornos muscoloesqueléticos. Este artículo tiene por objetivo evaluar el efecto de la irradiación ultrasónica de baja intensidad, con diferentes regímenes de pulsos y de intensidades, en cultivo celular de fibroblastos L929 (ATCC CCL-1 NCTC), para verificar la viabilidad celular y establecer los parámetros de dosimetría. Se utilizó el ultrasonido pulsado, con frecuencia de 1Mhz, en un cultivo de células fibroblásticas, divididas en cinco grupos (con control y con la intensidad instantánea del 0,3W/cm2-10%; 0,3W/cm2 -20%; 0,5W/cm2 -10% y US 0,5W/cm2-20 % - 100Hz). La irradiación se llevó a cabo en intervalos de 24, 48 y 72 horas, durante dos minutos y después de las 24 horas de cada irradiación se realizó la prueba de MTT {Bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]}. Los resultados mostraron que en la comparación entre los valores de células viables por el método MTT en los cinco grupos evaluados no ha sido posible encontrar ninguna diferencia estadísticamente significativa en los tres momentos evaluados (24, 48 y 72 horas). En cambio, al llevar a cabo el análisis de medida repetida en los diferentes grupos, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa solamente en el grupo irradiado con ultrasonido a 0,5W/cm2 con el régimen de pulso del 10% (p=0,003). Basándose en estos resultados se concluyó que la irradiación ultrasónica de baja intensidad en cultivo celular de fibroblastos L929 obtuvo el aumento sólo en el grupo con intensidad de 0,5W/cm2-10%, con significancia en todos los periodos de evaluación.

Within the physiotherapy practice there is a wide use of therapeutic ultrasound for the treatment of various musculoskeletal disorders. The aim of this study was to evaluate the effect of Low Intensity Ultrasonic irradiation with differents forms of pulse and intensity in cell culture of L929 fibroblasts (ATCC CCL-1 NCTC), in order to check cell viability and define parameters of dosimetry. For this purpose, it was used the application of pulsed ultrasound with a frequency of 1MHz in cultured fibroblast cells divided into five groups (control and instantaneous intensity of 0.3W/cm2-10%, 0.3W/cm2 -20%, 0.5W/cm2-10% and US 0.5W/cm2-20% - 100Hz). Irradiation occurred at intervals of 24, 48 and 72 hours for two minutes and 24 hours after each irradiation test MTT [3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] was performed. Results showed that when comparing the values of viable cells by MTT method in the five groups, we could not find statistically significant difference in any of them, in these three conditions (24, 48 and 72 hours); while. Whereas, when performing the analysis of repeated measures in the different groups, it was found a statistically significant difference only in the group irradiated with ultrasound at 0.5W/cm2 with pulse regime of 10% (p=0.003). Based on these results, it is concluded that the Low Intensity Ultrasonic irradiation in L929 fibroblast cell culture, only in the group with an intensity of 0.5W/cm2 -10% obtained numerical growth, with statistical significance in all periods evaluation.

Actividad antifúngica de extractos de biomasa celular de neem sobre aislamientos de dermatofitos / Antifungal activity of neem cellular biomass extracts on dermatophytes isolates

Las líneas celulares de neem (Azadirachta indica A. Juss.) cultivadas en suspensión líquida han demostrado producir metabolitos secundarios bioactivos, particularmente triterpenoides. En consecuencia, se han realizado estudios para el control de microorganismos de importancia médica, como los hongos dermatofitos. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar a través de un método de referencia in vitro la actividad antifúngica de diferentes extractos de cultivos celulares de neem sobre varios aislamientos de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Epidermophyton floccosum. Se realizó un escalado de cultivos de suspensiones celulares de neem, a partir de los cuales se obtuvo un extracto crudo metanólico. Éste extracto fue fraccionado posteriormente por cromatografía en columna de silica gel. Con los extractos obtenidos se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), siguiendo el método de microdilución en caldo M38-2, con cinco aislamientos de T. mentagrophytes, cinco de T. rubrum y tres de E. floccosum. Se usó como control positivo el antimicótico Terbinafina. Los resultados mostraron que el extracto crudo de biomasa celular de neem inhibe el crecimiento hasta en 100 % de T. mentagrophytes, T. rubrum y E. floccosum. Al evaluar las fracciones por separado, se observó que las de menor polaridad exhibieron en general mayor actividad antifúngica (CMI=109 μg/mL) que el extracto crudo per se (CMI=2500 μg/ mL) y las fracciones más polares (CMI=7000 μg/mL). Lo anterior indica que las células de neem cultivadas en suspensión producen compuestos con actividad antifúngica, siendo más bioactivos los presentes en las fracciones de menor polaridad.

Cell lines of neem (Azadirachta indica A. Juss.) grown in liquid suspension have shown to produce bioactive secondary metabolites, particularly triterpenoids. In consequence, its use as a control of medical microorganisms (like dermatophytes) is proposed. The main goal of this study was to assess the antifungal activity of methanolic extracts from neem cultured cell suspensions on several isolates of Trichophyton mentagrophytes (five isolates), Trichophyton rubrum (five isolates) and Epidermophyton floccosum (three isolates). Neem cell suspension cultures were scaled up, from which a raw methanolic extract was obtained. This extract was fractionated by silica gel column chromatography. The raw methanolic extract and its fractions were used in order to determine the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) on the dermatophytes isolates by following M38-A2 broth microdilution method. Antimycotic Terbinafine was used as positive control. The results shown that neem raw cellular biomass extract inhibits the growth of T. mentagrophytes, T. rubrum and E. floccosum in at least 100%. In the evaluations of the separated fractions, it was observed that the low polarity fractions had higher antifungal activity (MIC=109 μg/mL) than the raw extract per se (MIC=2500 μg/mL) and the most polar ones (MIC=7000 μg/mL). The latter suggest that neem cells cultured in liquid suspension produces compounds with antifungal activity, being more active those present in the low polarity fractions.

Establishment of a protocol for obtention of neuronal stem cells lineages from the dog olfactory epithelium / Estabelecimento de um protocolo para obtenção de linhagens de células-tronco neuronais a partir do epitélio olfatório de cães

A morphological and cell culture study from nasal mucosa of dogs was performed in order to establish a protocol to obtain a cell population committed to neuronal lineage, as a proposal for the treatment of traumatic and degenerative lesions in these animals, so that in the future these results could be applied to the human species. Twelve mongrel dogs of 60-day aged pregnancy were collected from urban pound dogs in São Paulo. Tissue from cribriform ethmoidal lamina of the fetuses was collected at necropsy under sterile conditions around 1h to 2h postmortem by uterine sections and sections from the fetal regions described above. Isolated cells of this tissue were added in DMEM/F-12 medium under standard conditions of incubation (5 percent CO², >37ºC). Cell culture based on isolated cells from biopsies of the olfactory epithelium showed rapid growth when cultured for 24 hours, showing phase-bright sphere cells found floating around the fragments, attached on culture flasks. After 20 days, a specific type of cells, predominantly ellipsoids or fusiform cells was characterized in vitro. The indirect immunofluorescence examination showed cells expressing markers of neuronal precursors (GFAP, neurofilament, oligodendrocyte, and III â-tubulin). The cell proliferation index showed Ki67 immunostaining with a trend to label cell groups throughout the apical region, while PCNA immunostaining label predominantly cell groups lying above the basal lamina. The transmission electron microscopy from the olfactory epithelium of dogs revealed cells with electron-dense cytoplasm and preserving the same distribution as those of positive cell staining for PCNA. Metabolic activity was confirmed by presence of euchromatin in the greatest part of cells. All these aspects give subsidies to support the hypothesis about resident progenitor cells among the basal cells of the olfactory epithelium, committed to renewal of these cell populations, especially neurons.

Foi realizado um estudo morfológico e por cultivo celular a partir de células provenientes da mucosa olfatória de cães, como forma de estabelecer um protocolo de cultivo, como uma proposta para o tratamento de lesões traumáticas e nervosas degenerativas nestes animais e futuramente, para que tais resultados possam ser aplicados a espécie humana. Foram utilizados doze cães sem raça definida, a termo, oriundos de castrações do Centro de Controle de Zoonoses de São Paulo. O tecido da lâmina cribiforme do etmóide dos fetos foi coletado sob necropsia, em condições estéreis, 1 a 2 horas post mortem, por meio de incisão uterina e acesso da região fetal supracitada. Depois as células isoladas desse tecido foram adicionadas em médio DMEM/F-12 sob condições padrão (5 por cento CO2, >37ºC). As células obtidas a partir de biópsias do epitélio olfatório de cães apresentaram rápido crescimento após 24 horas de cultivo, demonstrando morfologia esférica, sendo encontradas flutuando ao redor do fragmento aderido à garrafa de cultura. Após 20 dias, foram verificados tipos celulares específicos, predominantemente elipsóides ou fusiformes, foram observadas in vitro. Sob avaliação por imunofluorescência indireta observaram-se células com expressão positiva para marcadores de precursores neuronais (GFAP, Neurofilamentos, oligodendrócitos e â-tubulina III). O índice de proliferação celular mostrou-se positivo para Ki67 com uma tendência de marcação de grupos celulares ao longo da região apical, enquanto a imunomarcação para PCNA mostrou-se predominantemente em grupos celulares residentes sobre a lâmina basal. A microscopia eletrônica de transmissão do epitélio olfatório de cães revelou células com citoplasma eletrodenso e mesma distribuição das células marcadas positivamente para PCNA. A atividade metabólica foi confirmada pela presença de eucromatina em muitas regiões celulares. Todos estes aspectos sustentam a hipotese sobre a presença de células progenitoras ...

Establecimiento de un protocolo de permeabilización con detergentes que incrementa la eficiencia en la producción de betacianinas en cultivos de células de Beta vulgaris L / stablishment of a premeabilization protocol with detergents to increase betacianine production efficiency in a Beta vulgaris L. Cell cultures / Estabelecimento de um protocolo de permeabilização com detergentes que incrementa a eficiência na produção de betacianinas em cultivos de células de Beta vulgaris L

Se evaluó el efecto de cuatro detergentes, Tween 20, 40 y 80, y Tritón X-100® como agentes químicos permeabilizantes para la liberación de betacianinas (BC) de células en suspensión de Beta vulgaris. Se seleccionó el agente químico permeabilizante con base en la concentración de betacianinas liberadas y el tiempo de contacto. El contenido de BC se estimó usando medición de color por análisis de imágenes. Los resultados mostraron que la adición de Tritón X-100® 0,7mM durante 10min era suficiente para liberar el 36% de BC, con una viabilidad de 60-70%, y permitiendo además un nuevo ciclo de cultivo de las células tratadas y la acumulación paulatina de betacianinas durante el segundo ciclo.

Red beet (Beta vulgaris L.) cell suspensions were permeabilized by means of four chemical detergent agents, Tween 20, 40 and 80, and Triton X-100®, to evaluate the recovery of betacianins (BC). The permeabilizating agent was selected as a function of the quantity of BC released and the contact time. Betacianin concentration was measured using digital color image analysis. The results showed that 36% of betacianins was released using Triton X-100® (0.7mM) during 10min; using these extraction conditions, the viability remained at 60-70%. This treatment allowed a second growing-cycle, as well as, an additional accumulation of betacianins.

Avaliou-se o efeito de quatro detergentes, Tween 20, 40 e 80, e Tritón X-100® como agentes químicos permeabilizantes para a liberação de betacianinas (BC) de células em suspensão de Beta vulgaris. Selecionou-se o agente químico permeabilizante com base na concentração de betacianinas liberadas e o tempo de contacto. O conteúdo de BC se estimou usando medição de cor por análise de imágens. Os resultados mostraram que a adição de Tritón X-100® 0,7mM durante 10min era suficiente para liberar 36% de BC, com uma viabilidade de 60-70%, e permitindo além disso um novo ciclo de cultivo das células tratadas e a acumulação paulatina de betacianinas durante o segundo ciclo.

Las proteínas arabinogalactanos en cultivos de células vegetales / Arabinogalactan proteins in plant cell cultures / As proteínas arabinogalactanos em cultivos de células vegetais

Las proteínas arabinogalactanos (AGPs) son macromoléculas que se encuentran prácticamente en todos los órganos de las plantas, siendo asociadas con varios aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal. Estas moléculas se caracterizan bioquímicamente por contener carbohidratos y proteínas en relación 9:1. El carbohidrato está compuesto principalmente por arabinogalactanos tipo II; mientras que la parte proteica está organizada en dominios que definen a las AGPs como clásicas o no clásicas. Las primeras se caracterizan además por presentar una secuencia C-terminal que predice la incorporación de un grupo glicosilfosfatidilinositol (GFI), que permite su unión a la membrana plasmática. En cultivos de células vegetales se reportan varias especies que liberan AGPs al medio de cultivo. Se presenta una revisión de las características bioquímicas de las AGPs liberadas al medio y de las propuestas sobre los mecanismos bioquímicos y celulares por los cuales las AGPs participan en la diferenciación y crecimiento de las células vegetales. Los cultivos de células liberan al medio de cultivo AGPs clásicas y no clásicas, y se propone que podrían provenir de la membrana plasmática o la pared celular. Las AGPs intervienen en el control del crecimiento celular, además de estar relacionadas con la embriogénesis somática y la organogénesis, procesos de diferenciación celular importantes en los sistemas de micropropagación de plantas. El mecanismo bioquímico por el cual las AGPs participan en el crecimiento celular y la diferenciación implica que éstas, o los productos de su degradación, quizás actúen como moléculas de señalización.

The arabinogalactan proteins (AGPs) are macromolecules found in practically all plant organs, being associated with several aspects of the plant growth and development. These molecules contain carbohydrates and proteins in a 9:1 relation. The carbohydrate moiety is composed mainly of type II arabinogalactans, whereas the protein has particular amino acid domains that allow classifying the AGPs into two groups, classical and non-classical. In addition, the former are characterized by a C-terminal tail that predicts the incorporation of a glycosylphosphatidylinositol group (GPI) that allows the attachment of the AGPs to the plasma membrane. Plant cell cultures of several species release AGPs into the culture medium. The biochemical characteristics of the AGPs released into the medium, and the proposed biochemical and cellular mechanisms by which AGPs participate in plant cell differentiation and growth are reviewed. The plant cells release classical as well as non-classical AGPs into the culture medium. The origin of these AGPs could likely be the plasma membrane or the cell wall. They are involved in the control of cellular growth and differentiation processes, aspects that have fundamental importance in the induction of somatic embryogenesis and organogenesis, key steps in plant micropropagation programs. The biochemical mechanism by which the AGPs participate in cell growth and differentiation implies that the AGPs or their degradation products participate like signal molecules.

As proteínas arabinogalactanos (AGPs) são macromoléculas que se encontram praticamente em todos os órgãos das plantas, sendo associadas com vários aspectos do crescimento e desenvolvimento vegetal. Estas moléculas se caracterizam bioquímicamente por conter carboidratos e proteínas em relação 9:1. O carboidrato está composto principalmente por arabinogalactanos tipo II; enquanto que a parte protéica está organizada em domínios que definem as AGPs como clássicas ou não clássicas. As primeiras se caracterizam, além disso, por apresentar uma sequência C-terminal que prediz a incorporação de um grupo glicosilfosfatidilinositol (GFI), que permite sua união à membrana plasmática. Em cultivos de células vegetais se relatam várias espécies que liberam AGPs ao meio de cultivo. Apresenta-se uma revisão das características bioquímicas das AGPs liberadas ao meio e das propostas sobre os mecanismos bioquímicos e celulares pelos quais as AGPs participam na diferenciação e crescimento das células vegetais. Os cultivos de células liberam ao meio de cultivo AGPs clássicas e não clássicas, e se propõe que poderiam provir da membrana plasmática ou da parede celular. As AGPs intervêm no controle do crescimento celular, além de estar relacionadas com a embriogênese somática e a organogênese, processos de diferenciação celular importantes nos sistemas de micropropagação de plantas. O mecanismo bioquímico pelo qual as AGPs participam no crescimento celular e a diferenciação, implica que estas, ou os produtos de sua degradação, talvez atuem como moléculas de sinalização.

In vitro differentiation of embryonic stem cells into cardiac-like and neuronal-like cells / Indução de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em células de tecido cardíaco e nervoso

Embryonic stem cells are pluripotent cell lines with the capacity of self-renewal and a broad differentiation plasticity. They are isolated from preimplantation embryos and can be cultured in vitro for long time without losing their pluripotency. Embryonic stem cells can also differentiate in vitro with the proper combination of growth and differentiation factors, cells will differentiate into more advanced stages of embryogenesis generating different adult cell type. In the present study, we induced the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells (line R1) into cardiomyocytes and neuronal cells. These differentiations were evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction to verify presence of tissue-specific markers.

Células-tronco embrionárias são linhagens celulares pluripotentes capazes de se multiplicar indefinidamente e com grande capacidade de diferenciação celular. São isoladas de embriões em estágio pré-implantacional e podem ser cultivadas por longo tempo em laboratório sem perder sua pluripotencialidade. Células-tronco embrionárias podem, ainda, se diferenciar in vitro através da adição de fatores de crescimento e diferenciação ao meio de cultivo. As células se diferenciarão em estágios mais avançados de embriogênese, gerando tipos diferentes de células adultas. No presente estudo, induzimos a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos (linhagem R1) em células de tecido cardíaco e nervoso. A diferenciação foi avaliada pela reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa para verificar a presença de marcadores tecido-específicos.

Investigação do efeito do glutamato sobre o conteúdo de rEGF em linhagens celulares derivadas de glioblastomas humanos estabelecidas e caracterizadas

Os gliomas são as neoplasias cerebrais primárias que mais freqüentemente acometem o Sistema Nervoso Central (SNC). Cerca de 50% dos casos de gliomas são neoplasias com fenótipo maligno, incluindo os glioblastomas. Os glioblastomas possuem grande capacidade de expansão e invasão do tecido cerebral adjacente, o que contribui para o seu prognóstico sombrio. O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC, mas sob condições patológicas a ativação excessiva do sistema glutamatérgico provoca danos citotóxicos às células neurais. A toxicidade glutamatérgica está associada a uma série de doenças agudas e crônico-degenerativas que acometem o SNC. Os glioblastomas humanos são capazes de liberar quantidades tóxicas de glutamato sobre os tecidos adjacentes e esta liberação parece favorecer o crescimento e a expansão tumoral. A fim de avaliarmos se a progressão tumoral mediada pelo glutamato é desencadeada por elementos das vias de sinalização, investigamos o efeito do glutamato sobre o conteúdo e expressão do receptor do fator de crescimento epitelial (rEGF). Desta forma, os cultivos primários Gli1, Gli2 e Gli3, assim como a linhagem estabelecida U87MG, foram tratados com doses crescentes de glutamato (5-200 mM) por 48 horas e após o tratamento a viabilidade celular, os conteúdos de rEGF e de Akt foram avaliados. Os cultivos analisados apresentaram suscetibilidades distintas aos efeitos citotóxicos do glutamato, porém em todos os casos as doses efetivas foram muito superiores (valores de ICso de 45mM a 100mM) às concentrações tóxicas descritas para células neurais (valores de ICso de100uM a 1mM). A expressão protéica de rEGF e o conteúdo de Akt fosforilado aumentaram após o tratamento com 5mM de glutamato, sugerindo que a ativação dos receptores de EGF possam exercer função na via de sinalização desencadeada pelo glutamato. Após o término dos experimentos com glutamato dois dos três cultivos primários utilizados (Gli1 e Gli2) se mantiveram viáveis em cultivo por mais de 50 passagens, o que sugere estabilidade das alterações moleculares e a seleção de uma subpopulação especifica de células que pode ser denominada linhagem celular. Assim, em os à caracterização destas duas novas linhagens celulares derivadas de glioblastomas - Gli1 e Gli2. Para tal avaliamos as suas taxas de proliferação, morfologia celular, o perfil de cariótipo de ambas e os conteúdos de rEGF, Hsp70, 6, p53 e MMP2, marcadores relacionados à progressão tumoral. Em suma, os cultivos Gli1 e Gli2 demonstraram alterações cromossômicas e expressão de marcadores compatíveis com as anomalias descritas para a manifestação do fenótipo de glioblastomas. Igualmente, comparamos o crescimento destas linhagens glioblastomas cultivadas como monocamada com o cultivo tridimensional em esferóides multicelulares. Os resultados obtidos revelaram padrões de crescimento e conteúdos dos marcadores diferentes entre as condições de cultivo

The gliomas are the primary brain tumors that more frequntIy accomplished the Central Nervous System (CNS). About 50% of the glioma cases presented malignant phenotype, including glioblastomas. Glioblastoma are tumors with high capacity of proliferation and invasion through the adjacent healthy nervous tissue, which largely contributes for its poor prognosis. The glutamate is the main excitatory neurotransmitter of the CNS, but under pathological conditions the extreme activation of the glutamatergic system induces cytotoxic damages to the neural cells. The glutamatergic citotoxicity is associated with severaI acute and chronic-degenerative diseases of the CNS. Human glioblastomas are capable of release toxic amounts of glutamate on adjacent brain tissue and this release seems to favor tumoral growth and expansion. In order to evaluate if the tumoral progression mediated by glutamato is a product of the activation of elements 6f1he signaling pathways, we investigated the glutamate effect on the content and expression of EGFi . For this reason, the primary culture cells Gli1, Gli2 and Gli3, as well as the established cell line U-87MG, were treated with increasing doses of glutamate (5-200 mM) for 48 hours and after the treatment the cell viability, EGFr and Akt contents were evaluated. The studied cells presented distinct susceptibilities to the cytotoxic effects of glutamate, however in all the cell cultures the toxicity was revealed only with very high glutamate doses (values of ICso range from 45mM to 100mM) when compared to the described toxic concentrations for neural cells (ICso values range from 100uM to 1 mM). The EGFr protein expression and the phosphor-Akt content increased after the treatment with 5mM of glutamate, suggesting that the activation of the EGF receptors can have a role in the glutamate signaling pathways. After the conclusion of these set of experiments, twoof out three tested primary cultures remained viable in cell culture for more than 50 passages, which suggests stability of the molecular profile and the selection of a specific ce11 subpopulation that can be named by 0011 line. Thus, in order to characterize these two new glioblastoma cell lines (Gli1 and Gli2), we carry out a series of experiments. The experiments had included the evaluation of the cellular growth rate, the cellular morphology, the kariotype profile and the identification of molecular markers related to tumor progression (EGF, Hsp70, Ki76, p53 e MMP2). 80th glioblastoma cell lines had demonstrated chromosomic alterations and expression of molecular markers similar to those described for glioblastoma phenotype. Equally, we compared the growth of these cells in monolayer cultures to three-dimensional multicellular spheroids cultures. Accordingly the results demonstrated different standarts of growth and molecular markers between the culture conditions