Optimization of parameters for obtaining callus, suspension, and root cultures of meadowsweet (filipendula ulmaria) to isolate the largest number of biologically active substances with geroprotective properties / Otimização de parâmetros para obtenção de culturas de calos, suspensão e raiz de Ulmária (Filipendula ulmaria) para isolar o maior número de substâncias biologicamente ativas com propriedades geroprotetoras

The study of biologically active substances-secondary metabolites of plants that exhibit geroprotective properties is an actual and popular direction in medicine to prevent early aging. This work aims to select the cultivation parameters for obtaining in vitro cell cultures of meadowsweet containing the largest amount of biologically active substances (BAS) for their further extraction as candidate substances for geroprotectors. To specify the effectiveness of the selected cell culture cultivation parameters, biomass growth for callus and root cultures, growth index, specific growth rate, and viability for suspension cultures was carried out. The study results made it possible to select the nutrient media for the cultivation of cell cultures of meadowsweet. It has been found that the greater the antioxidant activity of the extracts, the greater the antimicrobial properties it exhibits. In this study, cell cultures in vitro and alcohol extracts from the plant Filipendula ulmaria were considered as raw materials rich in candidate substances for geroprotectors. According to the data obtained, the plant is rich in hydroxybenzoic and salicylic acids, spireoside, avicularin, and hyperoside.

O estudo de substâncias biologicamente ativas - metabólitos secundários de plantas que apresentam propriedades geroprotetoras - é uma tendência atual e popular no campo da medicina para a prevenção do envelhecimento precoce. O objetivo deste trabalho foi selecionar os parâmetros de cultivo para obtenção de culturas celulares in vitro de Ulmária contendo a maior quantidade de substâncias biologicamente ativas (SBA), para sua posterior extração como substâncias candidatas a serem geroprotetoras. Para especificar a eficácia dos parâmetros selecionados de cultivo em cultura de células, foi realizada a análise de crescimento de biomassa para culturas de calos e raízes, índice de crescimento, taxa de crescimento específica e viabilidade para culturas em suspensão. Os resultados do estudo possibilitaram a seleção do meio nutriente para o cultivo de células de Ulmária. Verificou-se que, quanto maior a atividade antioxidante dos extratos, maiores eram as propriedades antimicrobianas exibidas. Neste estudo, culturas celulares in vitro e extratos alcoólicos da planta Filipendula ulmaria foram considerados matérias-primas ricas em substâncias candidatas a serem geroprotetoras. De acordo com os dados obtidos, a planta é rica em ácidos hidroxibenzoico e salicílico, espirosídeo, avicularina e hiperosídeo.

Optimization of parameters for obtaining callus, suspension, and root cultures of meadowsweet (filipendula ulmaria) to isolate the largest number of biologically active substances with geroprotective properties

Abstract The study of biologically active substances-secondary metabolites of plants that exhibit geroprotective properties is an actual and popular direction in medicine to prevent early aging. This work aims to select the cultivation parameters for obtaining in vitro cell cultures of meadowsweet containing the largest amount of biologically active substances (BAS) for their further extraction as candidate substances for geroprotectors. To specify the effectiveness of the selected cell culture cultivation parameters, biomass growth for callus and root cultures, growth index, specific growth rate, and viability for suspension cultures was carried out. The study results made it possible to select the nutrient media for the cultivation of cell cultures of meadowsweet. It has been found that the greater the antioxidant activity of the extracts, the greater the antimicrobial properties it exhibits. In this study, cell cultures in vitro and alcohol extracts from the plant Filipendula ulmaria were considered as raw materials rich in candidate substances for geroprotectors. According to the data obtained, the plant is rich in hydroxybenzoic and salicylic acids, spireoside, avicularin, and hyperoside.

Resumo O estudo de substâncias biologicamente ativas metabólitos secundários de plantas que apresentam propriedades geroprotetoras é uma tendência atual e popular no campo da medicina para a prevenção do envelhecimento precoce. O objetivo deste trabalho foi selecionar os parâmetros de cultivo para obtenção de culturas celulares in vitro de Ulmária contendo a maior quantidade de substâncias biologicamente ativas (SBA), para sua posterior extração como substâncias candidatas a serem geroprotetoras. Para especificar a eficácia dos parâmetros selecionados de cultivo em cultura de células, foi realizada a análise de crescimento de biomassa para culturas de calos e raízes, índice de crescimento, taxa de crescimento específica e viabilidade para culturas em suspensão. Os resultados do estudo possibilitaram a seleção do meio nutriente para o cultivo de células de Ulmária. Verificou-se que, quanto maior a atividade antioxidante dos extratos, maiores eram as propriedades antimicrobianas exibidas. Neste estudo, culturas celulares in vitro e extratos alcoólicos da planta Filipendula ulmaria foram considerados matérias-primas ricas em substâncias candidatas a serem geroprotetoras. De acordo com os dados obtidos, a planta é rica em ácidos hidroxibenzoico e salicílico, espirosídeo, avicularina e hiperosídeo.

Efecto de la intensidad de las unidades de fotopolimerización sobre la biocompatibilidad y resistencia a la flexión de una resina compuesta

Objetivo: Determinar el efecto de la intensidad de dos unidades de fotopolimerización sobre la biocompatibilidad, resistencia flexural y módulo elástico de una resina compuesta. Metodología: Se crearon dos grupos de resina compuesta Filtek Z250XT cada uno fotopolimerizado con intensidades diferentes (800 mW/cm2 por 20s). La viabilidad celular fue analizada mediante ensayo de MTT a las 24 y 48 horas siguiendo la normativa ISO 10993-5. La resistencia flexural y módulo elástico fueron analizadas siguiendo la normativa ISO 4049. Resultados: En el grupo fotopolimerizado con una intensidad <400 mW/cm2, la citotoxicidad fue estadísticamente mayor tanto a las 24 como a las 48 horas y la resistencia flexural y módulo elástico fueron estadísticamente menores Conclusión: Una intensidad de polimerización <400 mW/cm2, aumenta los niveles de citotoxicidad y disminuye las propiedades mecánicas de las resinas compuestas. Se destaca la importancia del control periódico de las unidades de fotopolimerización.

Objetivo: Determinar o efeito da intensidade de duas unidades de fotopolimerização na biocompatibilidade, resistência à flexão e módulo de elasticidade de uma resina composta. Metodologia: Foram fabricados dois grupos de resina composta Filtek Z250XT, cada um deles foi fotopolimerizado com intensidades diferentes ( 800 mW/cm2 por 20s). A viabilidade celular foi analisada por ensaio de MTT em 24 e 48 horas seguindo a norma ISO 10993-5. A resistência à flexão e o módulo de elasticidade foram analisados ​​seguindo a norma ISO 4049. Resultados: No grupo fotopolimerizado com intensidade <400mW/cm2, a citotoxicidade foi estatisticamente maior nas 24 e 48 horas e a resistência à flexão e o módulo de elasticidade foram estatisticamente menores. Conclusão: Uma intensidade de polimerização <400 mW/cm2 aumenta os níveis de citotoxicidade e diminui as propriedades mecânicas das resinas compostas. Destaca-se a importância do controle periódico das unidades de fotopolimerização.

Objective: To determine the effect of the intensity of two light curing units on the biocompatibility, flexural strength and elastic modulus of a composite resin. Methodology: Two groups of Filtek Z250XT (3M ESPE) composite resin were created, each one photopolymerized using different intensities ( 800 mW/cm2 for 20s). Cell viability was analyzed by MTT assay at 24 and 48 hours following the ISO 10993-5 standard. The flexural strength and elastic modulus were analyzed following the ISO 4049 standard. Results: In the group photopolymerized with an intensity <400 mW/cm2, cytotoxicity was statistically higher both at 24 and 48 hours and flexural strength and elastic modulus were statistically lower. Conclusion: A polymerization intensity <400 mW/cm2 increases the levels of cytotoxicity and decreases the mechanical properties of composite resins. The importance of the periodic control of the light curing units is emphasized.

Analysis on the prokaryotic microbiome in females and embryonic cell cultures of Rhipicephalus sanguineus tropical and temperate lineages from two specific localities in Brazil / Análise do microbioma procarionte de fêmeas e cultura celular embrionária de Rhipicephalus sanguineus linhagens tropical e temperada de duas localidades no Brasil

Abstract Two lineages of Rhipicephalus sanguineus are known in Brazil: the temperate or southern and the tropical or northern populations. The distribution patterns of both lineages of R. sanguineus have epidemiological implications that can affect vectorial competence concerning Ehrlichia canis, the agent of canine monocytic ehrlichiosis. Intending to identify the microbiomes of both lineages and compare microorganisms in R. sanguineus, we used the 16S rRNA (V4-V5 region) gene-based metataxonomic approach, through NGS sequencing on the MiSeq Illumina platform. We selected specimens of females from the environment and samples of primary embryonic cell cultures, from both lineages, and this was the first study to investigate the prokaryotic microbiome in tick cell cultures. The results showed that many bacterial taxa detected in the samples were typical members of the host environment. A significant diversity of microorganisms in R. sanguineus females and in embryonic cell cultures from both lineages was found, with emphasis on the presence of Coxiella in all samples, albeit in different proportions. The Coxiella species present in the two lineages of ticks may be different and may have co-evolved with them, thus driving different patterns of interactions between ticks and the pathogens that they can harbor or transmit to vertebrate hosts.

Resumo Duas linhagens de Rhipicephalus sanguineus são conhecidas no Brasil: populações da linhagem temperada ou do sul, e tropical ou do norte. Os padrões de distribuição de ambas as linhagens de R. sanguineus têm implicações epidemiológicas, podendo afetar a competência vetorial de Ehrlichia canis, o agente etiológico da erliquiose monocítica canina. Com a intenção de identificar os microbiomas de ambas as linhagens e comparar microrganismos de R. sanguineus, foi utilizada a metataxonomia, baseada no gene 16S rRNA (região V4-V5), por meio do sequenciamento de nova geração na plataforma MiSeq Illumina. Foram selecionadas amostras de fêmeas do ambiente e cultivo primário de células embrionárias, considerando-se as duas linhagens conhecidas do Brasil. Este é o primeiro estudo que investiga o microbioma procariótico de células de cultura de carrapato. Os resultados mostram que muitos grupos de bactérias detectadas nas amostras são membros típicos do ambiente do hospedeiro. Uma diversidade significativa de microrganismos em fêmeas e cultura de células embrionárias nas duas linhagens de R. sanguineus foi encontrada, com ênfase na presença de Coxiella em todas as amostras, ainda que em diferentes proporções. Possivelmente, as espécies de Coxiella presentes nas duas linhagens de carrapatos são diferentes e co-evoluíram com essas linhagens, conduzindo a diferentes padrões de interação entre carrapatos e patógenos que podem abrigar ou transmitir aos hospedeiros vertebrados.

Avaliação dos efeitos do Bisfenol A em queratinócitos e células de neoplasia de cavidade oral / Evaluation of bisphenol A effects in keratinocytes and oral cavity neoplasia cells

O Bisfenol A (BPA) é um monômero utilizado na produção de garrafas plásticas, embalagens alimentícias, resinas odontológicas e vários outros materiais. Este monômero age como um desregulador do sistema endócrino e seus efeitos estão associados a cânceres em diferentes órgão e tecidos, como mama, próstata e tireóide. O BPA já foi detectado em fluidos humanos, incluindo saliva, mas os seus efeitos na mucosa bucal e em células orais neoplásicas não foram investigados. Os objetivos do presente trabalho foram 1) verificar os efeitos da exposição crônica ao BPA em glândulas salivares e mucosa bucal in vivo e 2) avaliar os efeitos do BPA in vitro em células de neoplasias bucais e queratinócitos; Para atender ao objetivo 1, camundongos machos e fêmeas receberam BPA (200 mg/mL) na água de beber durante 6 semanas. As mucosas orais (palato, língua e mucosa jugal) e as glândulas submandibulares foram avaliadas. Para atender ao objetivo 2, a resposta ao BPA foi examinada nas linhagens NOK-SI (queratinócito), HN12, HN13 (CCE de cavidade oral), UM HMC1 e UM HMC3a (neoplasia de glândula salivar). Os seguintes parâmetros foram avaliados: viabilidade, proliferação, invasão, angiogênese, produção de citocinas e fatores de crescimento e possíveis mecanismos de ação do BPA. Resultados. A exposição de camundongos ao BPA resultou em alterações microscópicas caracterizadas pelo aumento da espessura do epitélio da mucosa oral (palato, língua e mucosa jugal) e uma redução no número de ácinos das glândulas submandibulares. Foi observado também um acúmulo de BPA nos tecidos orais. In vitro, nas linhagens de CCE, o BPA aumentou a proliferação, invasão celular e os níveis da proteína vimentina, e ainda induziu a secreção de citocinas e fatores de crescimento, e a acetilação de histonas H3. Em queratinócitos orais, o BPA aumentou a proliferação celular e induziu a secreção de fatores de crescimento e a expressão de receptores de estrógeno (ER) α e ß. Os efeitos do BPA foram revertidos na presença do antagonista puro do ER. Nas linhagens de neoplasias de glândula o BPA não alterou a proliferação e induziu a expressão de p63. Em conclusão, o BPA induz alterações morfológicas nos tecidos bucais e alterações moleculares nos queratinócitos e nas células de CCE de cavidade oral. Os mecanismos pelos quais o BPA induz estas alterações são dependentes da interação BPA-ER e da acetilação de histonas.

Bisphenol A (BPA) is a monomer used to product plastic bottles, food packaging, inner coating of food cans, thermal papers, medical devices, dental resins and various other materials. Due to its chemical structure, this monomer acts as a deregulator of the endocrine system and its effects are associated with cancers in different organs and tissues such as breast, endometrium, ovary, prostate, testis and thyroid. BPA has been detected in several human fluids, including saliva, however its effects on the normal oral mucosa and neoplastic oral cells have not been investigated yet. Thus, the objectives of the present study were 1) to verify the effects of chronic exposure to BPA in salivary glands and oral mucosa in vivo and 2) to evaluate the effects of BPA in vitro on oral tumor cells and keratinocytes. To meet objective 1, male and female mice received BPA (200 mg / mL) in drinking water for 6 weeks. The oral mucosa (palate, tongue and buccal mucosa) and submandibular salivary glands were evaluated microscopically. To meet objective 2, the response to BPA was examined in immortalized cell lines NOK SI (keratinocyte); HN12, HN13 (OSCC), UM HMC1 and UM HMC3a (salivary gland tumor). The following parameters were evaluated: viability, proliferation, invasion, angiogenesis, cytokine and growth factors production. Results. Exposure of mice to BPA resulted in microscopic changes characterized by increased thickness of the oral mucosa epithelium (palate, tongue and buccal mucosa) and a reduction in the number of submandibular salivary glands acini. There was also an accumulation of BPA in the oral tissues. In vitro, in OSCC cells, BPA increased cell proliferation and invasion, vimentin expression, induced secretion of cytokines and growth factors, and induced histone H3 acetylation. In oral keratinocytes, BPA increased cell proliferation and induced secretion of growth factors and estrogen receptor (ER) α and ß expression. The effects of BPA were reversed in the presence of the pure ER antagonist. In salivary gland tumor cell lines, BPA did not alter the proliferation and induced the expression of p63. BPA mechanism of action involves its interaction with ER, since the effects were reverted in the presence of pure receptor antagonist. In conclusion, BPA induces morphological changes in oral tissues and molecular changes in keratinocytes and OSCC cells. The mechanisms which BPA induces these changes are dependent to the BPA-ER interaction and histone acetylation.

Vesículas extracelulares derivadas de macrófagos alteram o potencial de invasão, proliferação e migração de linhagens celulares do carcinoma de células escamosas de língua oral / Macrophage-derived extracellular vesicles alter the potential for invasion, proliferation, and migration of oral tongue squamous cell carcinoma cell lines

O câncer é composto pelas células malignas em proliferação associadas às diferentes células circunjacentes, formando o microambiente tumoral (TME), onde há uma constante troca de informações. Uma das formas de comunicação entre os diferentes tipos celulares do TME se dá por meio da liberação de vesículas extracelulares (EVs), um campo de estudo ainda pouco explorado. O presente estudo se propôs a avaliar os efeitos das EVs liberadas por macrófagos do TME, células altamente plásticas em seu fenótipo (M1 ­ perfil antitumoral; M2 ­ perfil pró-tumoral), em diferentes linhagens do carcinoma de células escamosas de língua oral (CCELO) no tocante à capacidade invasiva, proliferativa e migratória. Foi observado que as amostras de EVs extraídas dos macrófagos eram relativamente puras em EVs, porém subtipo inespecíficas. No ensaio de invasão em miomas, quando colocadas as células inflamatórias em cocultura com as células HSC-3, as células M1 inibiram a invasão e M2 aumentaram a capacidade invasiva das células malignas. Por outro lado, o tratamento com M1 EVs aumentou a capacidade invasiva das células HSC-3 e o tratamento com EVs de M2 inibiu a invasão dessas células, sendo observado um perfil semelhante nas células SCC-25 e SAS quando submetidas aos mesmos tratamentos. Na análise do marcador Ki-67 nos miomas, tanto as células HSC-3 quanto SCC-25 e SAS apresentaram o mesmo padrão de proliferação independentemente do tratamento utilizado, quando comparados com os respectivos controles negativos. Quando analisada a proliferação das células malignas no IncuCyte®, tratadas com EVs dos diferentes tipos de macrófagos em diferentes concentrações, foi identificado um aumento na capacidade proliferativa de células HSC-3 e SAS tratadas com M1 EVs em um padrão dose dependente. Um aumento da capacidade proliferativa seguindo um padrão dose dependente também ocorreu quando as células SAS foram tratadas com M2 EVs. Nos demais ensaios de proliferação no IncuCyte® também foram identificados efeitos na capacidade proliferativa, no entanto um padrão dose dependente não foi observado. No ensaio de migração no IncuCyte®, foram identificadas diferenças significativas na capacidade migratória de células SCC-25 e SAS tratadas com diferentes tipos de EVs nas diferentes concentrações, quando comparadas ao controle negativo. Os achados deste estudo sugerem que as EVs derivadas de macrófagos são fatores importantes na tumorigênese do CCELO, bem como abre discussões sobre os diferentes efeitos das células inflamatórias no TME a depender do tipo de comunicação celular executada (AU).

Cancer is an entity composed of proliferating malignant cells associated with the different types surrounding cells, forming the tumor microenvironment (TME), where there is a constant exchange of information. One of the ways of communicating between different types of TME cells is through the release of extracellular vesicles (EVs), a field of study that remains poorly understood. The aim of the present study was to evaluate the effects of EVs released from TME macrophages, which are cells highly plastic in their phenotype (M1 showing an anti-tumor profile and M2 exhibiting a pro-tumor profile) in different cell lines of tongue squamous cells carcinoma (TSCC) regarding to invasive, proliferative and migratory capacity. It was observed that EVs samples obtained from macrophages were relatively pure in EVs, although they were non-specific subtypes. In the myoma invasion assay, it was observed that when inflammatory cells were co-cultured with HSC-3 cells, M1 cells inhibited invasion and M2 increased the invasive ability of the malignant cells. On the other hand, treatment with M1 EVs increased the invasive capacity of HSC-3 cells, and treatment with M2 EVs inhibited the invasion of these malignant cells, and a similar profile was observed in SCC-25 and SAS cells when they were submitted to the same treatments. In the analysis of the Ki-67 marker in myomas, HSC-3, SCC-25 and SAS cells showed the same proliferation pattern regardless the type of the treatment used when compared to the respective negative controls. When it was analyzed the proliferation of malignant cells in IncuCyte® treated with EVs derived from different types of macrophages at different concentrations, an increase in the proliferative ability of HSC-3 and SAS cells treated with M1 EVs was observed in a dosedependent pattern. An increase in proliferative ability in dose-dependent profile was also observed when SAS cells were treated with M2 EVs. In the other proliferation assays performed in IncuCyte®, effects on proliferative capacity were also highlighted, however a dose-dependent pattern was not observed. In the IncuCyte® migration assay, significant differences were observed in the migration capacity of SCC-25 and SAS cells treated with different types of EVs at different concentrations when compared to the negative control. The findings of this study suggest that macrophages-derived EVs are pivotal factors in TSCC tumorigenesis, as well as permits discussions on the different effects of inflammatory cells on TME depending on the type of cell communication performed (AU).

Efeito de flavonoides sobre microrganismos de interesse endodôntico e sua influência na expressão de marcadores de mineralização / Effect of flavonoids on endodontic microorganisms and their influence on the expression of mineralization markers

O tratamento endodôntico de dentes permanentes jovens representa um grande desafio clínico devido a presença de paredes dentinárias finas, divergentes ou paralelas e ápice aberto, o que dificulta a desinfecção e a execução dos procedimentos convencionais. Terapias de regeneração endodôntica envolvem o uso de materiais capazes de promover uma desinfecção eficaz sem causar citotoxicidade, além de induzir a diferenciação de células-tronco ou bioestimular células remanescentes do tecido pulpar mesmo após a injúria. Nesse contexto, os flavonoides, polifenóis presentes em frutas e vegetais, poderiam ser agentes interessantes para o tratamento endodôntico de dentes imaturos devido a sua amplitude terapêutica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano, citotóxico e indutor de mineralização de flavonoides com finalidade de aplicação endodôntica. Este trabalho de tese foi dividido em três capítulos. O capítulo 1 avaliou a toxicidade dos flavonoides taxifolina, crisina, pinocembrina e galangina sobre fibroblastos pelo ensaio de MTT, a atividade antimicrobiana pela determinação da concentração inibitória e bactericida mínima, e a ação antibiofilme do flavonoide com melhor efeito antimicrobiano, por meio de ensaios em placas de poliestireno e em dentina radicular bovina por meio da análise por microscopia confocal. Os resultados mostraram que o flavonoide taxifolina não foi tóxico para os fibroblastos em nenhuma das concentrações analisadas, enquanto que os flavonoides crisina, pinocembrina e galangina apresentaram efeitos citotóxicos. Crisina, pinocembrina e galangina não apresentaram efeito antimicrobiano frente E. faecalis and S. mutans nas concentrações testadas. A taxifolina foi capaz de inibir todas as bactérias testadas, eliminar biofilmes de E. faecalis e S. mutans em placas de poliestireno e reduzir significantemente o biofilme de E. faecalis em túbulos dentinários. O capítulo 2 avaliou a citotoxicidade do flavonoide taxifolina e o seu potencial sobre a indução de marcadores de mineralização dentinária (produção de fosfatase alcalina - ALP, nódulos de mineralização ­ NM e expressão dos genes DSPP ­ sialofosfoproteína dentinária e DMP-1 ­ proteína da matriz dentinária - 1) em células semelhantes a odontoblastos MDPC-23, após tratamentos de 24, 72h e contínuo. A taxifolina não apresentou citotoxicidade em nenhum dos três tipos de tratamento analisados. Todas as concentrações do tratamento de 24h e as concentrações de 10 e 5µM do tratamento de 72h aumentaram a atividade de ALP. A formação de NM aumentou com os tratamentos de taxifolina à 10µM em ambos os tratamentos de 24 e 72h, e à 5µM no tratamento de 24h. A expressão de DMP-1 aumentou com o tratamento de taxifolina em ambos os tratamentos de 24 e 72h, enquanto que a de DSPP aumentou apenas com o tratamento de 72h na concentração de 5µM. O capítulo 3 avaliou a citotoxicidade da taxifolina, e o seu potencial sobre a indução de marcadores de mineralização óssea (ALP, NM e expressão dos genes ALP e colágeno 1 - Col-1) em células semelhantes a osteoblastos Saos-2, após tratamentos de 24, 72h e contínuo. Os resultados mostraram que os tratamentos com taxifolina nas concentrações de 10, 5 e 1µM não foram citotóxicos em nenhum dos períodos analisados. O tratamento de 72h da taxifolina à 10µM foi capaz de aumentar a atividade de ALP e a formação de NM, além de aumentar a expressão de Col-1 após 13 dias. O tratamento de 24h da taxifolina na concentração de 10µM aumentou a expressão de ALP após 6 dias. Conclui-se que a taxifolina é um flavonoide com potencial uso para o tratamento endodôntico de dentes permanentes jovens, devido à sua ação antimicrobiana/antibiofilme, baixa citotoxicidade e capacidade de estimular a mineralização em odontoblastos e osteoblastos(AU)

The endodontic treatment of young permanent teeth represents a great clinical challenge due to the presence of thin, divergent or parallel dentin walls and the open apex that makes it difficult to disinfect and perform conventional endodontic procedures. Endodontic regeneration therapies involve the use of materials capable of promoting effective disinfection without causing cytotoxicity, in addition to inducing differentiation of stem cells or biostimulating remaining pulp tissue cells even after injury. In this context, the flavonoids, polyphenols present in fruits and vegetables, could be interesting agents for the endodontic treatment of immature teeth due to the wide therapeutic use. Thus, the objective of the present study was to evaluate the antimicrobial, cytotoxic effects and capacity of mineralization induction of flavonoids for endodontic application. This thesis was divided into three chapters. The chapter 1 evaluated the toxicity of taxifolin, chrysin, pinocembrin and galangin flavonoids on fibroblasts by the MTT method, antimicrobial activity by determining the minimum inhibitory and bactericidal concentrations and analyzed the antibiofilm action of the flavonoid with the best antimicrobial effect, by means of the biofilm assays in polystyrene plates and in bovine root dentin and confocal microscopy analysis. The results showed that the flavonoid taxifolin was not toxic on fibroblasts in any tested concentration, while chrysin, pinocembrin and galangin flavonoids showed cytotoxic effects. Chrysin, pinocembrin and galangin showed no antimicrobial effect against E. faecalis and S. mutans in any tested concentrations. Taxifolin was able to inhibit all tested bacteria, to eliminate E. faecalis and S. mutans biofilms on polystyrene plates and significantly reduce E. faecalis biofilms from the dentin tubules. The chapter 2 evaluated the cytotoxicity of taxifolin and its potential on the induction of dentin mineralization markers (alkaline phosphatase production - ALP, mineralization nodules - MN and expression of genes DSPP - dentin sialophosphoprotein and DMP-1 - dentin matrix protein - 1) on odontoblast-like cells MDPC-23, after treatments of 24, 72h and continuous. Taxifolin did not present cytotoxicity at any of the three types of treatments analyzed. All concentrations of 24h-treatment and 10 and 5µM of 72htreatment increased ALP activity. NM formation increased with taxifolin treatments at 10µM in both 24 e 72h treatments, and at 5µM in the 24h-treatment. Expression of DMP-1 increased with taxifolin in both 24 e 72h-treatments, whereas DSPP expression increased only with 72h-treatment at 5µM. The chapter 3 evaluated the cytotoxicity of taxifolin and its potential on the induction of bone mineralization markers (ALP, NM and expression of ALP and collagen 1 -Col-1 genes) on Saos-2 osteoblast-like cells, after treatments of 24, 72h and continuous. The results showed that taxifolin treatments at 10, 5 and 1µM were not cytotoxic in any of the periods analyzed. The 72h-treatment of taxifolin at 10µM was able to increase ALP activity and NM formation, in addition to increasing Col-1 expression after 13 days. The 24h-treatment of taxifolin at 10µM increased ALP expression after 6 days. It is concluded that taxifolin is a flavonoid with potential use for endodontic treatment of young permanent teeth due to its antimicrobial/antibiofilm action, low cytotoxicity and ability to stimulate mineralization in odontoblasts and osteoblasts(AU)

Estudo in vitro do padrão de crescimento e proliferação celular de pré-osteoblastos humanos com bio-oss® e genox® / In vitro study of growth and proliferation of human pre-osteoblast on bio-oss® and genox®

Objetivo: O presente trabalho avaliou o padrão de crescimento, o índice de proliferação celular e morfologia de pré-osteoblastos humanos cultivados com Bio-Oss® e GenOx®. Material e Método: Pré-osteoblastos humanos MC3T3-E1 foram cultivados em contato com os biomateriais por 1, 24 e 72horas para avaliação da proliferação celular, medido com o teste colorimétrico MTS. Para a avaliação do padrão de crescimento e da morfologia celular, as células foram cultivadas por 24 e 72 horas, respectivamente e avaliadas sob microscopia de contraste de fase e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para verificação de diferenças no crescimento celular entre os grupos foi utilizado o teste one-way de ANOVA, sendo considerados significantes valores de p<0,05. Resultados: A proliferação celular foi maior na primeira hora nas amostras em contato com os biomateriais em comparação ao grupo controle. Nos períodos de 24 e 72 horas de cultivo celular, a curva de crescimento não mostrou diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0.05). Na microscopia de contraste de fase observou-se que as células cresceram em proximidade aos biomateriais, iniciando a formação da monocamada de maneira semelhante. Quando analisadas no MEV, as células cultivadas sobre os biomateriais apresentaram-se com formato fusiforme e núcleo arredado. Conclusão: Com a comparação do comportamento biológico de Bio-Oss® e GenOx®, realizada in vitro neste estudo, pôde-se observar que apesar das diferenças físico-químicas, o padrão, índice de crescimento e morfologia celular de Bio-Oss® e GenOx® se mostraram semelhantes, e que ambos materiais são biocompatíveis e representam uma boa opção como substitutos ósseos.

Objective: The present study aimed to evaluate the growth pattern, cell proliferation index and morphology of human preosteoblasts cultured with Bio-Oss® and GenOx®. Material and Methods: MC3T3-E1 human pre-osteoblasts were cultured in contact with biomaterials for 1, 24 and 72 hours for the cell proliferation assay with the colorimetric test MTS. For the growth pattern and cell morphology analysis, the cells were cultured for 24 and 72 hours, respectively, and evaluated under phase contrast microscopy and scanning electron microscopy. To verify differences in cell growth among the groups, the one-way ANOVA test was used (p <0.05). Results: In the first hour of cell culture the cell proliferation was pronounced in samples in contact with the biomaterials. At 24 and 72 hours of cell culture, no significant differences between the groups was observed in respect of cell proliferation. In phase contrast microscopy it was noted that the cells grew in proximity to the biomaterials, initiating the formation of a monolayer. When analyzed in the scanning electron microscopy, the cells cultured on the biomaterials presented a fusiform morphology and a round nucleus. Conclusion: Despite the physico-chemical differences between Bio- Oss® and GenOx®, these two biomaterials presented a similar growth index and cell morphology analysis, showing that both biomaterials are biocompatible and represent a good choice as bone substitutes.

Storage protocol of dental pulp cells from human exfoliated deciduous teeth / Protocolo de armazenamento de células pulpares de dentes decíduos humanos

Objetivo: O objetivo deste estudo foi isolar células do tecido pulpar de dentes decíduos humanos, avaliar a capacidade de proliferação, caracterizá-las e normatizar as técnicas de cultivo e expansão celular destas para a criação de um banco de células. Material e métodos: Dentes decíduos sem cárie e com indicação ortodôntica de para extração foram utilizados como doadores de tecido para a pesquisa. As células foram extraídas de tecidos pulpares, isoladas e cultivadas em condições ideais até alcançarem confluência. Resultados: Após consecutivas passagens, as células cultivadas foram caracterizadas por meio de técnicas de imunofluorescência e congeladas entre a 2ª e a 6ª passagem, criando-se um biorrepositório de células da polpa de dentes decíduos humanos. Conclusão: A criação de bancos de células pulpares de dentes decíduos humanos permite uma aplicação mais ágil nas pesquisas laboratoriais, reduzindo o tempo e o custo da obtenção de novas amostras. Evita necessidade de triagem e obtenção de novos doadores de dentes e tecidos, e permite maior rapidez nas repetições de protocolos de pesquisas. (AU)

Objective: This study aimed to isolate the cells from the dental pulp tissue of human primary teeth, study the capacity of proliferation, characterize the cells and standardize the technique of culture and expansion to create a cell banking. Material and Methods: Primary teeth with no caries and orthodontic reasons were extracted for pulp tissue obtainment. The cells were extracted from the pulp cells, isolated and cultured under ideal conditions until full expansion. Results: After consecutive passages, the cultured cells were characterized using immunofluorescence technique and frozen between the 2nd and 6th passage, thus creating a biorepository of dental pulp cells from human primary teeth. Conclusion: The creation of a cell banking from dental pulp cells from human primary teeth enables the easy application of cells in laboratorial studies, reducing the cost and time for obtaining the samples, avoid the involvement of new subjects and allow a fast reproducibility of the researches. (AU)

Characterization of cryopreserved primary human corneal endothelial cells cultured in human serum-supplemented media / Caracterização de células endoteliais corneanas humanas primárias criopreservadas cultivadas em meio suplementado com soro humano

ABSTRACT Purpose: To compare cryopreserved human corneal endothelial cells (HCECs) grown in human serum-supplemented media (HS-SM) with cryopreserved HCECs grown in fetal bovine serum-supplemented media (FBS-SM). Methods: Three pairs of human corneas from donors aged 8, 28, and 31 years were obtained from the eye bank. From each pair, one cornea was used to start a HCEC culture using HS-SM; the other cornea was grown in FBS-SM. On reaching confluence, the six cell populations were frozen using 10% dimethyl sulfoxidecontaining medium. Thawed cells grown in HS-SM were compared with those grown in FBS-SM with respect to morphology, growth curves, immunohistochemistry, real time-reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for endothelial cell markers, and detachment time. Results: No difference in morphology was observed for cells grown in the two media before or after cryopreservation. By growth curves, cell counts after thawing were similar in both media, with a slight trend toward higher cell counts in FBS-SM. Cells grown in both the media demonstrated a similar expression of endothelial cell markers when assessed by immunohistochemistry, although HCEC marker gene expression was higher in cells grown in HS-SM than in those grown in FBS-SM as assessed by RT-PCR. With FBS-SM, there was a tendency of longer detachment time and lower cell passages. Conclusions: HS-SM was similar to FBS-SM for cryopreservation of cultured HCECs as assessed by analysis of cell morphology, proliferation, and protein expression, although marker gene expression was higher in cells grown in HS-SM than in those grown in FBS-SM. Detachment time was longer with FBS-SM and in lower passages.

RESUMO Objetivo: Comparar células endoteliais de córnea humana (HCECs) criopreservadas e cultivadas em meio suplementado com soro humano (HS-SM) com HCEC criopreservadas e cultivadas em meio suplementado com soro bovino fetal (FBS-SM). Métodos: Três pares de córneas humanas de doadores com 8, 28 e 31 anos de idade foram obtidos do banco de olhos e, de cada par, uma córnea foi utilizado para iniciar uma cultura com HS-SM e outra com FBS-SM. Ao atingir a confluência, as populações de células foram congeladas utilizando-se dimetil-sulfóxido 10% no respectivo meio de cultura. Após descongeladas, as células cultivadas em HS-SM foram comparados com as cultivadas em FBS-SM por meio de morfologia, curva de crescimento, imuno-histoquímica, reação em cadeia de Reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) para marcadores de células endoteliais e tempo de descolamento. Resultado: Não foram observadas diferenças morfológicas antes ou após a criopreservação. Curva de crescimento mostrou contagens celulares semelhantes em ambos os meios, com discreta tendência para um maior número em FBS-SM. As células cultivadas em ambos os meios mostraram expressão semelhante de marcadores celulares endoteliais quando avaliadas por imuno-histoquímica, embora a expressão genética de marcadores para HCEC tenha sido maior em HS-SM quando avaliado por RT-PCR. Houve uma tendência de maior tempo de descolamento com FBS-SM e passagens iniciais. Conclusões: HS-SM foi semelhante ao FBS-SM na criopreservação de HCEC cultivadas in vitro quando avaliadas por morfologia celular, proliferação celular e expressão proteica, embora a expressão genética de marcadores endoteliais tenha sido maior em células cultivadas em HS-SM quando comparadas a células cultivadas em FBS-SM. O tempo de descolamento foi maior quando utilizado FBS-SM e em passagens iniciais.

Influência de diferentes densidades de energia do laser de baixa intensidade em fibroblastos derivados da polpa de dentes decíduos / Influence of low-level laser with different energy densities on pulp fibroblasts from human primary teeth

O objetivo deste trabalho foi comparar os efeitos de diferentes densidades de energia e irradiâncias do Laser de Baixa Intensidade (LBI), variando em função do tempo de irradiação e potência, na viabilidade e proliferação de fibroblastos derivados da polpa de dentes decíduos humanos (HPF). HPF foram cultivados em DMEM e usados entre a 4ª e 8ª passagem. Os grupos foram divididos de acordo com diferentes densidades de energia, variando: Tempo de irradiação - Grupo I Ia (1,2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), Ib (2,5 J/cm2 - 5 mW - 20 s), Ic (3,7 J/cm2 - 5 mW - 30 s), Id (5,0 J/cm2 - 5 mW - 40 s), e Ie (6,2 J/cm2 - 5 mW - 50 s); ou potência - Grupo II IIa (1,2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), IIb (2,5 J/cm2 - 10 mW - 10 s), IIc (3,7 J/cm2 - 15 mW - 10 s), IId (5,0 J/cm2 - 20 mW - 10 s), e IIe (6,2 J/cm2 - 25 mW - 10 s). Células não irradiadas - cultivadas em condições nutricionais regulares - 10% Soro Fetal Bovino (SFB) (If e IIf) e células não irradiadas - cultivadas em déficit nutricional - 1% SFB (Ig e IIg), foram consideradas controles positivos e negativos, respectivamente. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas, repesctivamente, pelas técnicas MTT e Cristal violeta (CV), nos períodos de 24, 48 e 72 horas após a irradiação. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística por ANOVA 2 critérios, seguido pelo teste de Tukey (P<0,05). No ensaio MTT, os controles negativos, Ig e IIg, apresentaram significativamente menor viabilidade em relação aos correspondentes grupos experimentais: IIa e IIb, 24 horas após a irradiação; Ia, Ib, Ie, If e IIf no período de 48 horas; e Ib-If, assim como, IIa-IIf após 72 horas. Nos diferentes períodos de avaliação do ensaio CV, todos os grupos, exceto Ie, IIe e If, exibiram significativamente maior proliferação em comparação aos respectivos controles negativos. Dentro de um mesmo grupo nos diferentes períodos, os grupos If e IIe apresentaram menor viabilidade durante o período de 24 horas em comparação ao período de 72 horas pelo ensaio MTT. Na avaliação intragrupos, o ensaio CV revelou menor proliferação no período de 24 horas em comparação aos períodos de 48 e 72 horas, independente do grupo avaliado. Os diferentes protocolos de irradiação, grupos I e II, não apresentaram diferença estatisticamente significativa na viabilidade e proliferação celular entre densidades de energia iguais com irradiâncias diferentes durante os períodos avaliados. De acordo com os resultados obtidos, as diferentes densidades de energia e irradiâncias propostas não prejudicaram a viabilidade e proliferação de fibroblastos pulpares de dentes decíduos humanos. A variação do protocolo de irradiação LBI, em função do tempo ou da potência, não interferiram nas respostas celulares após a aplicação da mesma densidade de energia com irradiâncias diferentes.(AU)

The aim of this study was to compare the effects of Low-level laser (LLL) with different energy densities and irradiances, varying according to the irradiation time and power, on cell viability and proliferation of pulp fibloblasts from human primary teeth (HPF). HPF were culture in DMEM and used between 4th and 8th passages. Groups were divided according to different energy densities, varying: Time of irradiation Ia (1.2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), Ib (2.5 J/cm2 - 5 mW - 20 s), Ic (3.7 J/cm2 - 5 mW - 30 s), Id (5.0 J/cm2 - 5 mW - 40 s), and Ie (6.2 J/cm2 - 5 mW - 50 s); or output power - Grupo II IIa (1.2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), IIb (2.5 J/cm2 - 10 mW - 10 s), IIc (3.7 J/cm2 - 15 mW - 10 s), IId (5.0 J/cm2 - 20 mW - 10 s), e IIe (6.2 J/cm2 - 25 mW - 10 s). Non-irradiated cells - grown in regular nutritional conditions - 10% Fetal Bovine Serum (FSB) (If and IIf) and non-irradiated cells - grown in nutritional deficit - 1% FBS (Ig and IIg) were considered positive and negative controls, respectively. Cell viability and proliferation were respectively assessed through MTT and Crystal violet (CV) assays at 24, 48 and 72h after irradiation. Data were submitted to statistical analysis by ANOVA 2 criteria, followed by Tukey test (P<0.05). In the MTT assay, the negative controls, Ig and IIg, showed significantly lower viability in relation to the corresponding groups: IIa and IIb 24 hours after irradiation; Ia, Ib, Ie, If and IIf at 48 hours period; and Ib-If, as IIa-IIf, after 72 hours. At different periods of evaluation of CV assay, all groups, except Ie, IIe and If, exhibited significantly higher proliferation compared to the respective negative controls. Within the same group at different periods, groups If and IIe showed lower viability during 24 hours compared to 72 hours period by MTT assay. In the intragroup evaluation, CV assay revealed lower proliferation at 24 hours compared to 48 and 72 hours periods, regardless of the evaluated group. Different irradiation protocols, groups I and II, showed no statistically significant differences on cell viability and proliferation among equals energy densities with different irradiances at the evaluated periods. According to these findings, different LLL energy densities and irradiances proposed did not impair viability and proliferation of pulp fibloblasts from human primary teeth. The variation of the LLL irradiation protocol, by the time or power, did not interfere in cellular responses after the application of the same energy density with different irradiances.(AU)

Avaliação dos eixos ECA / ANG II / AT1 e ECA-2 / ANG (1-7) / MAS em fibroblastos de gengiva e ligamento periodontal humanos estimulados por IL-1ß e sua contribuição na produção e regulação de citocinas e quimiocinas / Evaluation ACE /ANG II /AT1 and ACE-2 /ANG (1-7) /MAS axis in gingival and periodontal ligament human fibroblasts stimulated with IL-1ß and its contribution in the production of cytokines and chemokines

O Sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido relatado como um importante modulador de processos inflamatórios e imunológicos, incluindo a doença periodontal (DP). Estudos sugerem neste sistema um eixo alternativo (ECA-2 /ANG(1-7) /MAS) que atuaria como um contra-regulador de efeitos mediados pelo clássico eixo (ECA /ANGII /AT1). Sabe-se que bactérias periodontopatogênicas, como a Porphyromonas gingivalis (Pg), possuem componentes bioativos de membrana (ex. lipopolissacarídeos-LPS) capazes de induzir uma forte resposta imune no hospedeiro devido à liberação de citocinas nas células, entre elas Interleucina (IL)- 1ß. Neste contexto, fibroblastos são as células mais abundantes nos tecidos periodontais e possuem em sua superfície celular receptores necessários para o reconhecimento da invasão bacteriana, ativando cascatas intracelulares, que levam à produção de citocinas. O objetivo deste estudo foi verificar se os eixos ECA/ ANGII/ AT1 e ECA-2/ ANG(1-7)/ MAS contribuem para a produção e/ ou regulação de citocinas inflamatórias (CI) por fibroblastos de gengiva humana (HGF) e ligamento periodontal humano (HPLF) estimulados por IL-1ß. Após o pré-tratamento com Losartan e Ang (1-7) ou silenciamento mediado por RNA de interferência (RNAi) de AT1, HGF e HPLF foram estimulados por IL-1ß por 3 horas (RNAm) ou 24 horas (proteína). Expressão de RNAm para AT1, MAS, ECA, ECA-2, IL-1ß, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-ß, CXCL12, RANK-L e OPG foram avaliados por RT-qPCR e das proteínas IL-6, IL-8, ECA e ECA-2 por ELISA. Foi realizado também Western Blot para detecção de AT1 e ECA nos extratos celulares e dosagem de nitrito no sobrenadante das culturas. Ambos os subtipos de fibroblastos mostraram aumento da expressão de RNAm para AT1, IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α e OPG, quando estimulados por IL-1ß. No entanto, apenas em HPLF foi observado aumento para MAS, ECA e TGF-ß. Losartan e Ang (1-7) não modularam o transcrito, a secreção de CI e nem a produção de nitrito no sobrenadante das culturas, tanto em HGF como em HPLF. O silenciamento do receptor AT1 reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 induzida por IL-1ß em cultura de HGF e HPLF e aumentou a expressão gênica de OPG somente em HGF. Estes resultados sugerem que o silenciamento de AT1, mas não o bloqueio farmacológico deste receptor pelo antagonista Losartan, em HGF e HPLF, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal.(AU)

The renin-angiotensin system (RAS) has been reported as an important modulator of inflammatory and immune responses, including periodontal disease (PD). Studies suggest an alternative axis as part of this system (ACE-2 / ANG (1-7) / MAS) that would act as counter-regulatory to the classical axis (ECA / ANGII / AT1). It is known that periodontal bacteria such as Porphyromonas gingivalis (Pg) have bioactive components in their membrane (such as lipopolysaccharide-LPS) capable of inducing a strong immune response in the host due to the release of cytokines in cells, including interleukin (IL) - 1ß. In this regard, fibroblasts are the most abundant cells in periodontal tissues and receptors needed for the recognition of bacterial invasion by activating intracellular cascades that lead to cytokine production. The aim of this study was to determine whether the axes ACE / ANGII / AT1 and ACE-2 / ANG (1-7) / MAS contribute to the production and / or regulation of inflammatory cytokines (IC) by fibroblasts of human gingiva (HGF) and human periodontal ligament (HPLF) stimulated IL-1ß. After pre-treatment with Losartan, Ang (1-7) or silencing mediated by RNA interference (RNAi) of AT1, HGF and HPLF were stimulated by IL-1ß for 3 hours (RNAm) or 24 hours (protein). Expression mRNA for AT1, MAS, ACE, ACE-2, IL-1ß, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-ß, CXCL12, RANK-L and OPG was assessed by RT- qPCR and proteins IL-6, IL-8, ACE and ACE-2 by ELISA. Western Blot for the detection of AT1 and ECA and dosage of nitrite was also performed. Experiments stimulated by IL-1ß showed a positive control for gene expression AT1, IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α and OPG in HGF and HPLF and MAS, ACE and TGF-ß only HPLF. Losartan and Ang (1-7) did not modulate the transcription and secretion of IC and no nitrite production in the culture supernatant of HGF and HPLF. The silencing AT1 reduced IL-6 secretion and IL-8 induced by IL- ß in cultured HGF and HPLF and increased OPG gene expression only HGF. These results suggest that silencing AT1, but not pharmacological blockade of this receptor by Losartan in HPLF and HGF, can control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to the pathogenesis of periodontal disease.(AU)

Spermatogonial stem cells as a therapeutic alternative for fertility preservation of prepubertal boys / Espermatogônias-tronco como uma alternativa para a preservação da fertilidade de meninos pré-púberes

ABSTRACT Spermatogonial stem cells, which exist in the testicles since birth, are progenitors cells of male gametes. These cells are critical for the process of spermatogenesis, and not able to produce mature sperm cells before puberty due to their dependency of hormonal stimuli. This characteristic of the reproductive system limits the preservation of fertility only to males who are able to produce an ejaculate. This fact puts some light on the increase in survival rates of childhood cancer over the past decades because of improvements in the diagnosis and effective treatment in pediatric cancer patients. Therefore, we highlight one of the most important challenges concerning male fertility preservation that is the toxic effect of cancer therapy on reproductive function, especially the spermatogenesis. Currently, the experimental alternative for fertility preservation of prepubertal boys is the testicular tissue cryopreservationfor, for future isolation and spermatogonial stem cells transplantation, in order to restore the spermatogenesis. We present a brief review on isolation, characterization and culture conditions for the in vitro proliferation of spermatogonial stem cells, as well as the future perspectives as an alternative for fertility preservation in prepubertal boys. The possibility of restoring male fertility constitutes a research tool with an huge potential in basic and applied science. The development of these techniques may be a hope for the future of fertility preservation in cases that no other options exist, e.g, pediatric cancer patients.

RESUMO As espermatogônias-tronco, presentes nos testículos desde o nascimento, são as células progenitoras dos gametas masculinos, e, desse modo, críticas para o processo de espermatogênese. Antes da puberdade, essas células não são capazes de produzir espermatozoides maduros, o que só ocorrerá após o estímulo hormonal. Essa característica do sistema reprodutivo limita a possibilidade de preservação da fertilidade apenas para homens capazes de produzir um ejaculado. Tal fato coloca em evidência o aumento nas taxas de sobrevivência de crianças com câncer nas últimas décadas, devido principalmente à melhora no diagnóstico e ao tratamento dos pacientes pediátricos. Dessa forma, destaca-se um dos mais importantes desafios relativos à preservação da fertilidade masculina, que é o efeito tóxico das terapias anticâncer para o sistema reprodutivo, especialmente a espermatogênese. Tendo isso em vista, a alternativa experimental atualmente estudada para a preservação da fertilidade de pacientes pré-púberes é a criopreservação de tecido testicular para futuro isolamento e transplante de espermatogônias-tronco, a fim de restabelecer a espermatogênese. Apresentamos aqui uma breve revisão sobre isolamento, caracterização e condições de cultivo para a proliferação de espermatogônias-tronco, bem como as futuras perspectivas, como alternativa para preservação da fertilidade de meninos pré-púberes. A possibilidade de restabelecer a fertilidade masculina é uma ferramenta de pesquisa com potencial enorme de uso na pesquisa básica e aplicada. O desenvolvimento dessas técnicas pode fornecer uma esperança futura de preservação de fertilidade nos casos em que não há nenhuma outra opção, como para os pacientes pediátricos de câncer.

Cytotoxicity assays to evaluate tannery effluents treated by photoelectrooxidation / Ensaios de citotoxicidade na avaliação de efluentes de curtume tratados por fotoeletrooxidação

The advanced oxidation process (AOP) is used to increase the treatment efficiency of effluents however, it is necessary to compare the toxicity of treated and untreated effluents to evaluate if the decontamination process does not cause any biological harm. Cultured cells have been previously used to assess the genotoxic and cytotoxic potential of various compounds. Hence, the aim of this work was to assess the applicability of cytotoxicity assays to evaluate the toxicity related to the AOP treatment. Samples of an industrial effluent were collected after their treatment by a conventional method. Cytotoxicity of standard and AOP treated effluents was assessed in CRIB and HEp-2 cell line using the MTT and neutral red assays. We observed decrease at cell viability in the both assays (50% MTT and 13% NRU) when cells were exposed to the AOP treatment in the highest concentration. Thus, cytotoxic assays in cultured cells can be explored as an useful method to evaluate toxicity as well as to optimize effluents treatment process.

Resumo O processo de oxidação avançada (POA) tem sido usado para aumentar a eficiência do tratamento de efluentes; no entanto, é necessário comparar a toxicidade de efluentes tratados e não tratados para avaliar se o processo de descontaminação não é capaz de causar algum risco biológico. Cultivos celulares têm sido utilizados para avaliar o potencial genotóxico e citotóxico de vários compostos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade de ensaios de citotoxicidade para avaliar a toxicidade relacionada ao tratamento com POA. As amostras de um efluente industrial foram recolhidas após o tratamento por um método convencional. A citotoxicidade dos efluentes padrão e tratado com POA foi avaliada nas linhagens celulares CRIB e HEp-2 usando os ensaios do MTT e do vermelho neutro. Observou-se diminuição da viabilidade celular em ambos os ensaios (50% MTT e 13% VN) quando as células foram expostas à concentração mais elevada do efluente tratado com POA. Assim, os ensaios de citotoxicidade em cultivos celulares podem ser explorados como um método útil para avaliar a toxicidade, bem como para otimizar os processos de tratamento de efluentes.

Cytotoxicity assays to evaluate tannery effluents treated by photoelectrooxidation

The advanced oxidation process (AOP) is used to increase the treatment efficiency of effluents however, it is necessary to compare the toxicity of treated and untreated effluents to evaluate if the decontamination process does not cause any biological harm. Cultured cells have been previously used to assess the genotoxic and cytotoxic potential of various compounds. Hence, the aim of this work was to assess the applicability of cytotoxicity assays to evaluate the toxicity related to the AOP treatment. Samples of an industrial effluent were collected after their treatment by a conventional method. Cytotoxicity of standard and AOP treated effluents was assessed in CRIB and HEp-2 cell line using the MTT and neutral red assays. We observed decrease at cell viability in the both assays (50% MTT and 13% NRU) when cells were exposed to the AOP treatment in the highest concentration. Thus, cytotoxic assays in cultured cells can be explored as an useful method to evaluate toxicity as well as to optimize effluents treatment process.

Resumo O processo de oxidação avançada (POA) tem sido usado para aumentar a eficiência do tratamento de efluentes; no entanto, é necessário comparar a toxicidade de efluentes tratados e não tratados para avaliar se o processo de descontaminação não é capaz de causar algum risco biológico. Cultivos celulares têm sido utilizados para avaliar o potencial genotóxico e citotóxico de vários compostos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade de ensaios de citotoxicidade para avaliar a toxicidade relacionada ao tratamento com POA. As amostras de um efluente industrial foram recolhidas após o tratamento por um método convencional. A citotoxicidade dos efluentes padrão e tratado com POA foi avaliada nas linhagens celulares CRIB e HEp-2 usando os ensaios do MTT e do vermelho neutro. Observou-se diminuição da viabilidade celular em ambos os ensaios (50% MTT e 13% VN) quando as células foram expostas à concentração mais elevada do efluente tratado com POA. Assim, os ensaios de citotoxicidade em cultivos celulares podem ser explorados como um método útil para avaliar a toxicidade, bem como para otimizar os processos de tratamento de efluentes.

Desenvolvimento e testes in vitro de um novo corante para terapia fotodinâmica em Periodontia / Development and in vitro tests of a new dye for photodynamic therapy in Periodontics

A terapia fotodinâmica antimicrobiana (Antimicrobial Photodynamic Therapy - aPDT) tem sido utilizada em Periodontia para redução bacteriana de bolsas periodontais na forma de tratamento adjuvante da raspagem e alisamento radicular. Seu efeito em cirurgias periodontais é pouco estudado. Pesquisas recentes têm procurado descobrir novos fotossensibilizadores para aumento da efetividade dessa terapia. O objetivo do presente estudo foi testar in vitro um novo corante à base de corantes fenotiazínicos para uso em aPDT, quanto à sua biocompatibilidade e efetividade em eliminar bactérias. Foram realizados testes para avaliar a desmineralização e desgaste causados pelo corante em esmalte e dentina bovinos, bem como o tempo de aplicação ideal para se conseguir efeitos semelhantes ao ácido cítrico; comportamento óptico dos novos corantes em relação aos corantes convencionais; teste de biocompatibilidade de fragmentos de raiz humana, tratados pelo corante, em culturas de fibroblastos gengivais humanos; efetividade dos novos corantes sozinhos ou associados ao laser na eliminação de S. aureus e E. coli. Nos experimentos de desmineralização e biocompatibilidade foi utilizado um laser vermelho (660nm, 30mW, 45J/cm2, 30s) e nos experimentos com bactérias laser vermelho (660nm, 100mW, 45J/cm2, 12s). As análises estatísticas foram realizadas com testes paramétricos e não paramétricos (p<0,05). Os resultados mostraram que o novo corante promoveu desmineralização em esmalte (perda de dureza 55,5% e desgaste 10,33μm) e dentina (perda de dureza 65,9% e desgaste 8,37μm) bovinos de forma semelhante ao ácido cítrico, sendo 180s, o tempo mais adequado. Nos ensaios ópticos, observou-se que o novo corante à base de azul de toluidina (NCTBO) reduziu a banda de absorção para 575nm e teve uma fotodegradação mais rápida, enquanto que à base de azul de metileno (NCMB) o pico manteve-se em 660nm com fotodegradação lenta. O crescimento de fibroblastos gengivais humanos sobre superfícies de raiz...

The antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is used in Periodontics for reduction of bacteria in periodontal pockets as an adjuvant treatment to scaling and root planning. Recent researches aim at finding new photosensitizers in order to improve its effectiveness. The aim of this study was to test in vitro the biocompatibility and efficiency of eliminating bacteria of a new phenothiazine-based dye for aPDT in Periodontics. The following tests were performed: magnitude of demineralization and wear in bovine dentin and enamel fragments; the ideal time of application to obtain results similar to citric acid conditioning; optic behavior of new dye compared to conventional dyes; biocompatibility of human root fragments treated by the new dye in human gingival fibroblasts culture; effectiveness of the new dye in elimination of S. aureus and E. coli. In the experiments of demineralization and biocompatibility a red laser (660nm, 30mW, 45J/cm2, 30s) was applied, while in the microbiology experiments the parameters were changed (660nm, 100mW, 45J/cm2, 12s). The statistical analysis were done with parametric and non-parametric tests (p<0.05). The results showed that the new dye promoted demineralization in bovine enamel (surface hardness loss 55.5% and wear 10.33μm) and dentin (surface hardness loss 65.9% and wear 8.37μm). The demineralization was similar to citric acid and the ideal time of application was 180s. The optic tests showed that the toluidine blue-based new dye (TBOND) diminished the absorption band to 575nm and had a faster photodegradation. The methylene blue-based new dye (MBND) maintained a peak of absorption in 660nm and had a slower photodegradation. Growth of human gingival fibroblasts onto human root surfaces was similar to those treated with regular dyes (3.07 x 2.6 cells after 72h). The TBOND when used alone, reduced E. coli and S. aureus in 59.6% e 54.6%, respectively. When associated to laser, the reduction of E. coli was 52.6%. The MBND...

In vitro cytotoxicity of self-curing acrylic resins of different colors

OBJECTIVE: The aim of this study was to assess the in vitro cytotoxicity of acrylic resins of different colors over time. METHODS: Specimens were divided into 4 groups (n = 6) according to the color of the acrylic resin (Orto Class, Clássico, Campinas, São Paulo, Brazil): Group 1: clear acrylic resin; group 2: pink acrylic resin; group 3: blue acrylic resin and group 4: green acrylic resin. All specimens were fabricated according to the mass manipulation technique and submitted to mechanical polishing protocol. The control was performed with an amalgam specimen (C+), a glass specimen (C-) and cell control (CC). Specimens were immersed in Minimum Eagle's Medium (MEM) and incubated for 24 h at 37o C. The extracts from the experimental material were filtered and mixed with L929 fibroblast. Cytotoxicity was evaluated at 4 different times, 24, 48, 72 and 168 h. After contact, cells were incubated for 24 h and added to 100 µ of 0.01% neutral red dye. The cells were incubated for 3 h for pigment incorporation and fixed. Cells viability was determined by a spectroscopic (BioTek, Winooski, Vermont, USA) with a 492-nm wavelength λ=492 nm). RESULTS: There were no statistical differences between the experimental groups and the CC and C- groups. CONCLUSION: Clear, pink, blue and green self-curing acrylic resins fabricated by means of the mass manipulation technique and mechanically polished are not cytotoxic. Neither the pigment added to the self-curing acrylic resin nor the factor of time influenced the cytotoxicity of the material. .

OBJETIVO: avaliar, in vitro, a citotoxicidade de resinas acrílicas autopolimerizáveis, de diferentes cores, ao longo do tempo. MÉTODOS: os corpos de prova foram divididos em quatro grupos (n = 3), de acordo com a cor da resina acrílica utilizada (Orto Class, Clássico, São Paulo/SP), sendo: grupo 1, acrílica incolor; grupo 2, acrílica rosa; grupo 3, acrílica azul; e, grupo 4, acrílico verde. Todos os corpos de prova foram confeccionados pela técnica de massa e polidos mecanicamente. Um corpo de prova de amálgama, um de vidro e célula constituíram o controle positivo (C+), controle negativo (C-), e controle de célula (CC), respectivamente. Em seguida, esses foram imersos em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) por 24h, quando se removeu o sobrenadante e colocou-os em contato com fibroblastos L929. Avaliou-se a citotoxicidade em quatro períodos: 24, 48, 72 e 168h. Após o contato com o meio, as células foram incubadas por 24h e adicionou-se 100µ do corante vermelho neutro a 0,01%. Posteriormente, as células foram incubadas por 3h, para incorporação do corante, e fixadas. A contagem das células viáveis foi realizada em espectrofotômetro (BioTek, Winooski, EUA), com um comprimento de onda de 492nm (λ = 492nm). RESULTADOS: não houve diferença estatística entre os grupos experimentais e os grupos CC e C-. CONCLUSÇÕES: as resinas acrílicas autopolimerizáveis incolor, rosa, azul e verde, manipuladas pela técnica de massa e polidas mecanicamente não são citotóxicas. O corante utilizado em resinas autopolimerizáveis e tempo não influenciam na citotoxocidade do material. .

Effect of standard and neutral-pH peritoneal dialysis solutions upon fibroblasts proliferation / Efeito da solução de diálise peritoneal com pH neutro e padrão sobre a proliferação de fibroblastos

Introduction: Continuous exposition of the peritoneal membrane to conventional dialysis solutions is an important risk factor for inducing structural and functional alterations. Objective: To compare in vitro mouse fibroblast NIH-3T3 cell viability after exposition to a neutral pH dialysis solution in comparison to cells exposed to a standard solution. Methods: Experimental study to compare the effects of a conventional standard or a neutral-pH, low-glucose degradation products peritoneal dialysis solution on the viability of exposed fibroblasts in cell culture. Both solutions were tested in all the commercially available glucose concentrations. Cell viability was evaluated with tetrazolium salt colorimetric assay. Results: Fibroblast viability was significantly superior in the neutral pH solution in comparison to control, in all three glucose concentrations (Optical density in nm-means ± SD: 1.5% 0.295 ± 0.047 vs. 0.372 ± 0.042, p < 0.001; 2.3% 0.270 ± 0.036 vs. 0.337 ± 0.051, p < 0.001; 4.25% 0.284 ± 0.037 vs. 0.332 ± 0.032, p < 0.001; control vs. neutral pH respectively, Student t Test). There was no significant difference in cell viability between the three concentrations of glucose when standard solution was used (ANOVA p = 0.218), although cell viability was higher after exposition to neutral pH peritoneal dialysis fluid at 1.5% in comparison to 2.3 and 4.25% glucose concentrations (ANOVA p = 0.008: Bonferroni 1.5% vs. 2.3% p = 0.033, 1.5% vs. 4.25% p = 0.014, 2.3% vs. 4.25% p = 1.00). Conclusion: Cell viability was better in neutral pH dialysis solution, especially in the lower glucose concentration. A more physiological pH and lower glucose degradation products may be responsible for such results. .

Introdução: A exposição contínua da membrana peritoneal a soluções convencionais de diálise é um importante fator de risco para induzir alterações estruturais e funcionais. Objetivo: Comparar a viabilidade in vitro dos fibroblastos NIH-3T3 de camundongo após exposição à solução de diálise com pH neutro com células expostas à solução padrão. Métodos: Estudo experimental; ambas as soluções foram testadas em todas as concentrações de glicose comercialmente disponíveis. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio colorimétrico de sal tetrazólio. Resultados: A viabilidade de fibroblastos foi melhor na solução de pH neutro em relação ao controle nas três concentrações de glicose (densidade óptica em nm-médias ± DP: 1,5% 0,295 ± 0,047 vs. 0,372 ± 0,042, p < 0,001; 2,3% 0,270 ± 0,036 vs. 0,337 ± 0,051, p < 0,001; 4,25% 0,284 ± 0,037 vs. 0,332 ± 0,032, p < 0,001; controle vs. pH neutro respectivamente, teste t de Student). Não houve diferença significativa na viabilidade celular entre as três concentrações de glicose quando solução padrão foi utilizada (ANOVA p = 0,218), embora a viabilidade celular tenha sido superior após exposição aos fluidos de diálise peritoneal neutros, pH 1,5% em comparação com 2,3 e 4,25% de concentrações de glicose (ANOVA p = 0,008: Bonferroni 1,5% vs. 2,3% p = 0,033, 1,5% vs. 4,25% p = 0,014, 2,3% vs. 4,25% p = 1,0). Conclusão: A viabilidade celular foi melhor em solução neutra de pH de diálise, especialmente nas menores concentrações de glicose. O pH fisiológico e com menos produtos de degradação de glicose podem ser responsáveis por estes resultados. .

Caracterização de osteoblastos diferenciados de células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) / Characterization of osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells from spontaneously hypertensive rats (SHR) bone marrow

A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada a expressão do receptor β1 tanto em SHR como em Wistar. Com base nesses resultados, podemos concluir que os osteoblastos diferenciados das CTMs de...

Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest that overexpression of β2 adrenergic receptors may have acted in prejudice of osteoblastic differentiation

Efeito do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) no ciclo de replicação do vírus da hepatite C (VHC) / Effects of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) on the replication cycle of the hepatitis C virus

Estima-se que 170 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas com o vírus da hepatite C (VHC), o que está altamente relacionado à ocorrência de hepatite crônica e carcinoma hepatocelular. A prevalência de esteatose hepática em doentes com hepatite C crônica é muito maior do que na população geral variando entre 40 a 75%. A associação entre a infecção pelo VHC e esteatose hepática é multifatorial. Duas formas de esteatose hepática são encontradas em pacientes com hepatite C crônica: esteatose metabólica (fatores de risco) e citopática relacionada ao genótipo 3a. Os lipídios são essenciais para o ciclo de replicação do VHC, eles podem exercer seu efeito em diferentes níveis como: grupos prostéticos em proteínas virais e/ou cofatores celulares na replicação de VHC, componentes especializados na estrutura do VHC onde ocorre a replicação ou como constituinte das partículas lipovirais. Trabalhos experimentais realizados anteriormente por nosso grupo relataram que a administração do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) promove a inibição do desenvolvimento da esteatose, redução dos marcadores de estresse oxidativo, menor escore de inflamação, melhora nas concentrações de aminotransferases e diminuição da gordura visceral em um modelo animal de esteato-hepatite não alcoólica. A terapia padrão da hepatite C consiste em uma combinação de interferon peguilado alfa (PEG-IFN-alfa) que estimula o sistema imunológico do hospedeiro para combater a infecção e o composto antiviral ribavirina. Atualmente foram aprovados pelas agências de saúde os inibidores de protease Boceprevir, Telaprevir, Daclatasvir e Simeprevir. No entanto, sua eficiência varia entre os genótipos e as constantes mutações do vírus podem levar a resistência. A falta de uma vacina ou uma terapia definitiva faz com que diversos compostos com diferentes mecanismos de ação sejam testados como possíveis alternativas de tratamento. Tendo em vista a capacidade do YHK de reduzir a esteatose e a importância...

Worldwide is estimated that nearly 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV), highly correlated with the occurrence of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis C patients present higher prevalence of steatosis when compared with the general population, ranging between 40% and 75%. There are two forms of steatosis in HCV infected patients: metabolic steatosis (risk factors) and cytopathic associated with genotype 3. Lipids are essential for the HCV replication cycle. It acts on different functions: as prosthetic groups into viral proteins and / or cellular cofactors in the HCV replication, as specific HCV components or as a constituent of lipovirals particles. Our group previously reported that the administration of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) inhibits steatosis development, decreases markers of oxidative stress and inflammation, improves aminotransferases concentration and decreases the visceral fat. Standard therapy for hepatitis C is a combination of pegylated interferon alpha (PEG-IFN-alfa), stimulating the host immune system to fight infection and the antiviral compound named ribavirin. Nowadays, Telaprevir, Boceprevir, Sofosbovir and Simeprevir are approved as new anti-HCV drugs; they act as protease inhibitors. Its efficiency, however, varies between genotypes, and the constant mutations of the virus can lead to resistance. The lack of vaccines, or a definitive therapy, stimulates the research of new compounds and alternative treatments. In this study, we evaluated the effect of YHK in HCV replication cycle due to the effect of YHK and the importance of lipid metabolism for HCV. For this purpose we used cell culture techniques allowing the study of different stages of HCV replication cycle: entry (HCVpp), replication - replicons JFH1 NS3-5B and Con1, also replication and infection-JC1-Fluc. We also used active compounds of its ingredients: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1...