Validación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) acoplada a curvas melting como herramienta alternativa para el diagnóstico de Tuberculosis Mutidrogorresistente / Validation of the real time polymerase chain reaction (qPCR) coupled to melting curves as an alternative tool for the diagnosis of Multi-Drug Resistant Tuberculosis

INTRODUCCIÓN: la tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por diversas especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis, actualmente se estima que un tercio de la población mundial se encuentra afectada por lo que representa una amenaza para la salud pública, principalmente por el surgimiento de cepas Multidrogorresistentes (TB-MDR). En Bolivia se reportaron 7.538 personas enfermas con Tuberculosis, los últimos datos sobre TB-MDR indican un aumento de 0,2% por año, en 2019 se registró un 3,1% de TB-MDR. Actualmente en nuestro país se emplean métodos moleculares para la identificación de este agente infeccioso; no obstante, existen muy pocos o ningún trabajo acerca de la aplicación de métodos moleculares para la detección precisa y efectiva de cepas TB-MDR que otorguen validez a los resultados emitidos. Este trabajo resuelve el cuestionamiento de, si la PCR en tiempo real (RT-qPCR) acoplada a curvas melting es una herramienta de diagnóstico alternativo aplicable, para la identificación de Tuberculosis Multidrogorresistente MATERIALES Y MÉTODOS: se trabajó con 74 cepas de Mycobaterium tuberculosis fenotípicamente identificadas por cultivo (método de las proporciones, Canetti Rist) como gold standar. El material genético para las pruebas moleculares se obtuvo por el método de columnas, se utilizaron dos controles primarios para la determinación de resistencia a los fármacos Isoniacida y Rifampicina, tanto los controles como las muestras se procesaron por RT-qPCR acoplada a curvas melting, mediante cambios de temperatura de disociación. RESULTADOS: los parámetros de test diagnóstico de la prueba demostraron sensibilidad: 67.4%, especificidad: 83.3%, Exactitud: 73.97%, VPP: 85.3%, VPN: 64.1% para Isoniacida. Mientras que para Rifampicina: Sensibilidad: 97%, especificidad: 20%, exactitud: 58.9%, VPP: 55.4% y VPN: 87.5%. CONCLUSIÓN: el método evaluado para la determinación de resistencia a Isoniacida presenta un equilibrio entre sensibilidad y especificidad, por lo que representa una alternativa diagnóstica confiable, mientras que para resistencia a Rifampicina presenta una alta sensibilidad que es muy útil para países endémicos como el nuestro.

INTRODUCTION: tuberculosis is an infectious-contagious disease, caused by various species of the Mycobacterium tuberculosis Complex, it is estimated that one third of the world population is affected by what represents a threat to public health, mainly by the emergence of multidrugresistant strains (MDR-TB). In Bolivia, 7,538 people are reported sick with Tuberculosis, the latest data on MDR-TB indicate an increase of 0.2% per year, in 2018 there was 3.1% of MDR-TB. Currently in our country molecular methods are used to identify this infectious agent; however, there is very little or no work on the application of molecular methods for the precise and effective detection of MDR-TB strains that give validity to the results issued. This work resolves the question of whether real-time PCR (RT-qPCR) coupled to melting curves is an applicable alternative diagnostic tool for the identification of multidrug-resistant tuberculosis MATERIALS AND METHODS: we worked with 74 strains of Mycobaterium tuberculosis phenotypically identified by culture (method of proportions, Canetti Rist) as a gold standar. The genetic material for molecular methods was obtained by the column assay, two primary controls were used for the determination of resistance to the drugs Isoniazid and Rifampicin, both the controls and the samples were processed by RT-qPCR coupled to melting curves, by means of temperature changes of dissociation. RESULTS: the diagnostic test parameters of the test demonstrated sensitivity: 67.4%, specificity: 83.3%, Accuracy: 73.97%, PPV: 85.3%, NPV: 64.1% for Isoniazid. While for Rifampicin: Sensitivity: 97%, Specificity: 20%, Accuracy: 58.9%, PPV: 55.4% and NPV: 87.5% CONCLUSION: the method evaluated for the determination of resistance to Isoniazid presents a balance between sensitivity and specificity, therefore it represents a reliable diagnostic alternative, while for resistance to Rifampicin it presents a high sensitivity that is very useful for endemic countries such as ours.

Estandarizacion de la PCR en tiempo real por análisis de curvas melting para la detección de tuberculosis drogoresistente / Standardization of real-time PCR by analysis of fusion curves for the detection of drug-resistant tuberculosis

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por diversas especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis, actualmente se estima que un tercio de la población mundial se encuentra afectada por lo que representa una amenaza para la salud pública, principalmente por el surgimiento de cepas Multidrogorresistentes (MDR-TB) que presentan resistencia a Rifampicina e Isoniacida simultáneamente, fármacos de primera línea para el tratamiento de esta enfermedad. En la actualidad se emplean métodos moleculares para la detección de este agente infeccioso, en nuestro medio existen muy pocos o ningún trabajo acerca de la aplicación de métodos moleculares para la detección precisa y efectiva de cepas MDR-TB, es decir que además de identificar su presencia pueda darse un perfil de resistencia por lo menos a fármacos de primera línea. En este trabajo se estandarizó la técnica PCR en Tiempo Real por Análisis de Curvas Melting para la detección mutaciones en genes específicos que otorgan resistencia a estos antituberculosos utilizando un kit comercial. Se utilizaron once cepas de Mycobaterium tuberculosis fenotípicamente identificadas por cultivo y cuatro controles primarios del método para la determinación de resistencia Isoniacida y Rifampicina mediante cambios de temperatura de disociación. Los resultados de esta estandarización reflejaron que el método utilizado puede ser optimizado en rendimiento de reactivos y tiene una concordancia mayor al 80 % en el caso de Rifampicina, y más de 90% en el caso de Isoniacida en comparación con los datos fenotípicos. El método estandarizado disminuye el tiempo de detección de tuberculosis y permite obtener perfiles de resistencia a los principales antituberculosos de primera línea.

Tuberculosis is an infectious-contagious disease, caused by several species of the Mycobacterium tuberculosis complex, today it is estimated that one third of the world population representing a threat to public health, mainly by the emergence Multidrug-resistant strains (MDR-TB) that express resistance to Rifampicin and Isoniazid simultaneously. Although currently molecular methods are used for the detection of this infectious agent, in our medium there are no studies about the application of molecular methods for the accurate and effective detection of MDR-TB strains. The present study intends to standardize the Real Time PCR technique by Melting Curves Analysis for the detection of mutations in specific genes that cause resistance to these antituberculosis drugs. Eleven strains of Mycobaterium tuberculosis phenotypically identified by culture and primary controls of the method for the determination of resistance Isoniacida and Rifampicina by changes of temperature of dissociation were used. The results of this standardization showed that the method used can be optimized in reagent performance and correlates more than 80% with phenotypic results. The standardized method improves the time detection of tuberculosis and allows to obtain resistance profiles to the main first-line antituberculosis drugs.