Production of recombinant EMA-1 protein and its application for the diagnosis of Theileria equi using an enzyme immuno assay in horses from São Paulo State, Brazil / Produção da proteína recombinante EMA-1 e sua aplicação para o diagnóstico baseadono imuno ensaio enzimático de Theileria equi em equinos do Estado de São Paulo, Brasil

The erythrocytic-stage surface protein, Equi Merozoite Antigen 1 (EMA-1), is a major candidate for the development of a diagnostic antigen for equine piroplasmosis. In order to establish an effective diagnostic method for practical use, the gene encoding the entire EMA-1 of Theileria equi Jaboticabal strain was cloned and expressed in Escherichia coli as a histidine-tagged protein (His6-EMA1). The expressed EMA-1 reacted with specific antibodies in Western blot and had an apparent molecular mass of 34 kDa which was largely consistent with its theoretical value. The nucleotide sequence of the EMA-1 gene of Jaboticabal strain was comparatively analyzed with other published sequences. The results indicated a high degree of homology with EMA-1 genes of all other strains isolated from various countries. The recombinant purified His6-EMA1 protein was tested in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies anti-T. equi in horses. The ELISA clearly differentiated T. equi-infected from Babesia caballi-infected horse sera or normal horse sera. Field serum samples collected from horses in the State of São Paulo, Southeastern Brazil, were examined for the diagnosis of T. equi infection by ELISA. Of 170 samples analyzed, 95.88 percent (163/170) were positive for T. equi infection. These results suggest that the His6-EMA1 protein expressed in E. coli could be a reliable immunodiagnostic antigen for ELISA test and that T. equi infection is a serious concern in the State of São Paulo, Brazil.

A proteína de superfície eritrocitária, Antígeno 1 do Merozoíta de Theileria equi (EMA-1), é um potencial candidato para o desenvolvimento de antígenos de valor diagnóstico para a piroplasmose equina. Com o objetivo de estabelecer um método de diagnóstico efetivo e prático, o gene EMA-1 da amostra Jaboticabal - SP de T. equi foi clonado e expresso em Escherichia coli contendo uma cauda de poli-histidina (His6-EMA1). O EMA-1 expresso reagiu com anticorpos específicos no Western blot e apresentou peso molecular aparente de 34 kDa, sendo altamente consistente com seu valor teórico. A sequência nucleotídica do gene EMA-1 da amostra Jaboticabal foi analisado comparativamente com outras sequências públicas, e os resultados indicam elevado grau de homologia com amostras de diversos países. A proteína recombinante purificada His6-EMA1 foi testada no ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de anticorpos anti-T. equi em equinos. O teste de ELISA diferenciou-se claramente entre soros de equinos infectados por T. equi, soros de animais infectados por Babesia caballi e soro normal de equino. Amostras de soros coletadas de equinos do Estado de São Paulo, sudeste do Brasil, foram examinadas para o diagnóstico da infecção por T. equi pelo ELISA. Das 170 amostras analisadas, 95,88 por cento (163/170) foram positivas para T. equi. Os resultados sugerem que a proteína His6-EMA1 expressa em E. coli pode ser um antígeno confiável para diagnóstico imunológico pelo teste de ELISA, e que T. equi merece grande atenção no Estado de São Paulo.

Immunogenicity and antigenicity of the recombinant EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris / Imunogenicidade e antigenicidade da proteína recombinante EMA-1 de Theileria equi expressa em Pichia pastoris

The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is one of the most important parasitic diseases of the equine, causing damage to animal health and economic losses. In T. equi, 2 merozoite surface proteins, equi merozoite antigen EMA-1 and EMA-2, have been identified as the most immunodominant antigens. This suggests that these antigens might be used as immunobiological tools. The EMA-1 of Theileria equi was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. The transformed yeast was grown at high cell density, expressing up to 389 mg.L-1 of recombinant protein. The protein was concentrated and detected in Dot blot. The recombinant product was antigenically similar to the native protein as determined using monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies obtained from equines naturally infected with T. equi. The immunogenicity of rEMA-1 protein was demonstrated by IFAT using sera from recombinant-protein-immunized mice using aluminum hydroxide as adjuvant. All animals vaccinated with rEMA-1 developed a high specific antibody response. This results suggest that rEMA-1expressed in P. pastoris might be a strong candidate to be used as an antigen for immune diagnostics as well as a vaccine antigen.

A piroplasmose equina causada por Theileria equi é uma das mais importantes doenças parasitárias de equídeos, causando danos a saúde animal e perdas econômicas. Em T. equi, 2 proteínas de superfície de merozoítos, equi merozoite antigen EMA-1 e EMA-2, têm sido identificadas como antígenos imunodominantes. Sugerindo que estes antígenos possam ser usados como produtos imunobiológicos. O gene EMA-1 de T. equi foi clonado e expressado na levedura Pichia pastoris. As leveduras transformadas foram cultivadas a altas densidades celulares expressando 389 mg.L-1 de proteína recombinante. A proteína foi concentrada e detectada em Dot blot. O produto recombinante foi antigenicamente similar à proteína nativa quando determinado usando anticorpo monoclonal e anticorpos policlonais obtidos de equinos naturalmente infectados com T. equi. A imunogenicidade da proteína rEMA-1 foi demonstrada por RIFI utilizando soro de camundongos imunizados com proteína recombinante usando hidróxido de alumínio como adjuvante. Todos os animais vacinados com rEMA-1 desenvolveram uma alta resposta específica de anticorpos. Esses resultados sugerem que rEMA-1 expressa em P. pastoris possa ser um candidato para ser usado como antígeno para diagnóstico imunológico bem como antígeno para vacinas.

Immunogenicity and antigenicity of the recombinant EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris

The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is one of the most important parasitic diseases of the equine, causing damage to animal health and economic losses. In T. equi, 2 merozoite surface proteins, equi merozoite antigen EMA-1 and EMA-2, have been identified as the most immunodominant antigens. This suggests that these antigens might be used as immunobiological tools. The EMA-1 of Theileria equi was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. The transformed yeast was grown at high cell density, expressing up to 389 mg.L-1 of recombinant protein. The protein was concentrated and detected in Dot blot. The recombinant product was antigenically similar to the native protein as determined using monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies obtained from equines naturally infected with T. equi. The immunogenicity of rEMA-1 protein was demonstrated by IFAT using sera from recombinant-protein-immunized mice using aluminum hydroxide as adjuvant. All animals vaccinated with rEMA-1 developed a high specific antibody response. This results suggest that rEMA-1expressed in P. pastoris might be a strong candidate to be used as an antigen for immune diagnostics as well as a vaccine antigen.

A piroplasmose equina causada por Theileria equi é uma das mais importantes doenças parasitárias de equídeos, causando danos a saúde animal e perdas econômicas. Em T. equi, 2 proteínas de superfície de merozoítos, equi merozoite antigen EMA-1 e EMA-2, têm sido identificadas como antígenos imunodominantes. Sugerindo que estes antígenos possam ser usados como produtos imunobiológicos. O gene EMA-1 de T. equi foi clonado e expressado na levedura Pichia pastoris. As leveduras transformadas foram cultivadas a altas densidades celulares expressando 389 mg.L-1 de proteína recombinante. A proteína foi concentrada e detectada em Dot blot. O produto recombinante foi antigenicamente similar à proteína nativa quando determinado usando anticorpo monoclonal e anticorpos policlonais obtidos de equinos naturalmente infectados com T. equi. A imunogenicidade da proteína rEMA-1 foi demonstrada por RIFI utilizando soro de camundongos imunizados com proteína recombinante usando hidróxido de alumínio como adjuvante. Todos os animais vacinados com rEMA-1 desenvolveram uma alta resposta específica de anticorpos. Esses resultados sugerem que rEMA-1 expressa em P. pastoris possa ser um candidato para ser usado como antígeno para diagnóstico imunológico bem como antígeno para vacinas.