Tissue engineering perspectives in dentistry: review of the literature / Perspectivas da engenharia tecidual na Odontologia: revisão de literatura

ABSTRACT Tooth losses due to pathological processes continue to be a reality in daily clinical dentistry, inducing functional and psychological complications in patients. In view of this, a new option for the management of this problem - tissue engineering - has been studied in Dentistry. This field, considered multidisciplinary, uses three key elements for tissue regeneration: scaffolds (extracellular matrices) - natural or synthetic; cells, and growth factors. In this sense, combination of these three elements may induce regeneration of the dental pulp, bone and periodontal tissue, among others. Therefore, the aim of this study was to conduct a literature review, describing the main elements of tissue engineering and their applicability in Dentistry, as a means of updating dental surgeons about this subject.

RESUMO As perdas dentárias, devido aos processos patológicos, ainda são uma realidade na clínica odontológica diária, induzindo complicações funcionais e psicológicas ao paciente. Diante disso, uma nova opção para o manejo desse problema vem sendo estudada na Odontologia, a engenharia tecidual. Essa área, considerada multidisciplinar, utiliza três elementos chaves para a regeneração dos tecidos: os scaffolds (matriz extracelular) naturais ou sintéticos, as células e os fatores de crescimento. Nesse sentido, a combinação desses três elementos pode induzir a regeneração da polpa dentária, tecido ósseo e periodontal, entre outros. Portanto, o objetivo deste estudo é realizar uma revisão da literatura, descrevendo e atualizando os cirurgiões-dentistas sobre os principais elementos da engenharia tecidual e sua aplicabilidade na Odontologia.

Control of the skin scarring response

There comes a time when the understanding of the cutaneous healing process becomes essential due to the need for a precocious tissue repair to reduce the physical, social, and psychological morbidity. Advances in the knowledge on the control of interaction among cells, matrix and growth factors will provide more information on the Regenerative Medicine, an emerging area of research in medical bioengineering. However, considering the dynamism and complexity of the cutaneous healing response, it is fundamental to understand the control mechanism exerted by the interaction and synergism of both systems, cutaneous nervous and central nervous, via hypothalamus hypophysis-adrenal axis, a relevant subject, but hardly ever explored. The present study reviews the neuro-immune-endocrine physiology of the skin responsible for its multiple functions and the extreme disturbances of the healing process, like the excess and deficiency of the extracellular matrix deposition.

Aproxima-se uma época na qual é fundamental a compreensão do processo cicatricial cutâneo frente à necessidade da restauração tecidual precoce, visando a diminuição das morbidades física, social e psicológica. O avanço no conhecimento acerca do controle das interações entre as células, a matriz e os fatores de crescimento dará maiores informações à Medicina Regenerativa, área de pesquisa emergente da bioengenharia médica. Entretanto, diante do dinamismo e complexidade da resposta cicatricial cutânea torna-se indispensável o entendimento do mecanismo de controle exercido pela interação e sinergismo do sistema nervoso cutâneo e o sistema nervoso central, via eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, tema relevante, porém, pouco abordado. O presente estudo revisa a fisiologia neuro-imuno-endócrina da pele, responsável por suas múltiplas funções, e os distúrbios extremos do processocicatricial, como o excesso e deficiência de deposição da matriz extracelular.

Immunoarchitectural characterization of a human skin model reconstructed in vitro / Caracterização morfológica e imunoistoquímica de um modelo de pele humana reconstruída in vitro

CONTEXT AND OBJECTIVE: Over the last few years, different models for human skin equivalent reconstructed in vitro (HSERIV) have been reported for clinical usage and applications in research for the pharmaceutical industry. Before release for routine use as human skin replacements, HSERIV models need to be tested regarding their similarity with in vivo skin, using morphological (architectural) and immunohistochemical (functional) analyses. A model for HSERIV has been developed in our hospital, and our aim here was to further characterize its immunoarchitectural features by comparing them with human skin, before it can be tested for clinical use, e.g. for severe burns or wounds, whenever ancillary methods are not indicated. DESIGN AND SETTING: Experimental laboratory study, in the Skin Cell Culture Laboratory, School of Medical Sciences, Universidade Estadual de Campinas. METHODS: Histological sections were stained with hematoxylin-eosin, Masson's trichrome for collagen fibers, periodic acid-Schiff reagent for basement membrane and glycogen, Weigert-Van Gieson for elastic fibers and Fontana-Masson for melanocytes. Immunohistochemistry was used to localize cytokeratins (broad spectrum of molecular weight, AE1/AE3), high molecular weight cytokeratins (34βE12), low molecular weight cytokeratins (35βH11), cytokeratins 7 and 20, vimentin, S-100 protein (for melanocytic and dendritic cells), CD68 (KP1, histiocytes) and CD34 (QBend, endothelium). RESULTS: Histology revealed satisfactory similarity between HSERIV and in vivo skin. Immunohistochemical analysis on HSERIV demonstrated that the marker pattern was similar to what is generally present in human skin in vivo. CONCLUSION: HSERIV is morphologically and functionally compatible with human skin observed in vivo.

CONTEXTO E OBJETIVO: Nos últimos anos, diferentes modelos de pele humana reconstruída in vitro (PHRIV) foram descritos para uso clínico e aplicações em pesquisa na indústria farmacêutica. Antes de serem liberados para uso rotineiro como substitutos de pele humana, os modelos de PHRIV necessitam de testes (estudos) comparativos com a pele humana in vivo, por meio de análises morfológica (arquitetural) e imunoistoquímica (funcional). O objetivo deste trabalho é estudar as características imunoistoquímicas de um modelo de PHRIV desenvolvido em nosso serviço, comparando-as com a pele humana, para que esse modelo de PHRIV possa vir a ser testado clinicamente em casos de queimaduras e ulcerações de pele nos quais métodos tradicionais de tratamento não estejam indicados. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo experimental laboratorial realizado no Laboratório de Cultura de Células da Pele da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (FCM/Unicamp), Campinas, São Paulo, Brasil. MÉTODOS: Cortes histológicos foram corados com hematoxilina-eosina, tricrômio de Masson para fibras colágenas, ácido periódico-reagente de Schiff para membrana basal e glicogênio, Weigert-Van Gieson para fibras elásticas e Fontana-Masson para melanócitos. Estudo imunoistoquímico foi realizado para identificar citoqueratinas de amplo espectro de pesos moleculares (AE1/AE3), citoqueratinas de alto peso molecular (34βE12), citoqueratinas de baixo peso molecular (35βH11), citoqueratinas 7 e 20, vimentina, proteína S-100 (para melanócitos e células dendríticas), CD68 (KP1, histiócitos) e CD34 (QBend, endotélio). RESULTADOS: A histologia revelou similaridade satisfatória entre PHRIV e a pele in vivo. O estudo imunoistoquímico da PHRIV demonstrou padrão semelhante de marcadores usualmente presentes na pele humana in vivo. CONCLUSÃO: A PHRIV estudada é morfológica e funcionalmente compatível com a pele humana observada in vivo.

Cultura de condrócitos em arcabouço tridimensional: hidrogel de alginato / Chondrocyte cultures in tridimensional scaffold: alginate hydrogel

OBJETIVOS: O presente estudo teve como objetivo cultivar condrócitos retirados da articulação do joelho de coelhos encapsulados em hidrogel de alginato (HA) e caracterizar a produção de matriz extracelular (ECM). MÉTODOS: A cartilagem articular foi removida do joelho de coelhos, com três a seis meses, fragmentada em pedaços de 1mm e submetida à digestão enzimática. Uma concentração de 1x106 céls/mL foram ressuspensas em uma solução de alginato de sódio a 1,5 por cento (w/v), em seguida fez-se o processo de gelatinização em CaCl2 (102 mM), permitindo a formação do HA e cultivo em meio DMEM-F12 durante quatro semanas. A distribuição das células e a ECM foram acessadas através das secções histológicas coradas com e azul de toluidina hematoxilina e eosina (HE). RESULTADOS: Houve um aumento no número e na viabilidade dos condrócitos durante as quatro semanas de cultura. Através das análises histológicas dos HAs corados com azul de toluidina e HE foi possível observar a distribuição definida dos condrócitos no hidrogel, assemelhando-se a grupos isógenos e formação de matriz territorial. CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou a eficiência do HA como arcabouço para ser usado na cultura de condrócitos, constituindo uma alternativa no reparo de lesões na cartilagem articular.

OBJECTIVES: The aim of this study was to culture chondrocytes from knee joint cartilage of rabbits encapsulated in alginate hydrogel (HA) and to characterize the production of extracelular matrix (ECM). METHODS: Joint cartilage was obtained from rabbits' knees, three to six months old, fragmented into 1-mm pieces and submitted to enzymatic digestion. A concentration of 1x106 cells/mL were re-suspended into a 1.5 percent (w/v) sodium alginate solution, followed by gel formation process with CaCl2 (102 mM), allowing HA to build for culturing it into a DMEM-F12 medium for four weeks. The distribution of cells and ECM were assessed from histological slices stained toluidine blue and hematoxyline-eosin (HE). RESULTS: There was an increase of the number and viability of the chondrocytes during the four weeks of culture. By assessing the histological sections stained with toluidine blue and HE, we could note the definitive distribution of chondrocytes in the hydrogel, similarly to isogenous groups and territorial matrix formation. CONCLUSION: In this study, the alginate was shown to be an effective scaffold for use in chondrocytes culture, constituting an alternative for repairing joint cartilage defects.

Gel de plaquetas: arcabouço 3D para cultura celular / Platelet gel: 3D scaffold for cell culture

INTRODUÇÃO: O reparo tissular é o objetivo final da cirurgia. A cultura celular requer arcabouço mecânico que dê suporte ao crescimento celular e difusão dos nutrientes. O uso do plasma rico em plaquetas (PRP) como um arcabouço 3D possui diversas vantagens: é material biológico, de fácil absorção pós-transplante, rico em fatores de crescimento, em especial PDGF- ββ e TGF-β que estimula síntese de matriz extracelular na cartilagem. OBJETIVO: Desenvolver arcabouço 3D à base de PRP. MATERIAIS E MÉTODOS: Duas formas foram idealizadas: Sphere e Carpet. Condições estéreis foram utilizadas. O gel de plaquetas permaneceu em cultura celular, observado diariamente em microscópio invertido. RESULTADOS: Ambos arcabouços obtiveram sucesso, com aspectos positivos e negativos. DISCUSSÃO: A forma Sphere não aderiu ao plástico. Observou-se retração do gel e investigação ao microscópio dificultada devido às áreas opacas no campo visual. A forma Carpet não aderiu ao plástico e apresentou-se translúcida. O tempo de estudo foi de 20 dias. CONCLUSÕES: A produção de um arcabouço 3D PRP foi um sucesso, e trata-se de uma alternativa que necessita ser mais utilizado e investigado para que se consolide em uma rota eficiente e confiável na tecnologia de engenharia tissular, particularmente em cultura de tecido cartilaginoso.

INTRODUCTION: Tissue repair has been the ultimate goal of surgery. Cell culture requires a mechanical scaffold that supports cell growth and nutrient diffusion. Using platelet-rich plasma (PRP) as a 3D scaffold presents various advantages: it is a biological material, easily absorbed after transplantation, rich in growth factors, in particular, PDGF-ββ and TGF-β that stimulate extracellular matrix synthesis in cartilage culture. OBJECTIVE: To develop a PRP 3D scaffold. Material and METHODS: Two forms were idealized: Sphere and Carpet. Sterile conditions were used. The platelet gel remained in culture conditions, observed at an inverted microscope on a daily basis. RESULTS: Both forms were successful because they produced a 3D environment that supports cell growth, with positive and negative features. DISCUSSION: The Sphere form didn't attach to the plate. Gel retraction was observed and the investigation at the microscope was difficult, because of the opaque areas in the optical field. The Carpet form didn't retract, and didn't produce opaque areas. Follow-up time was 20 days. CONCLUSIONS: The production of a PRP 3D scaffold was successful, and this is an alternative requiring further investigation in order to establish an efficient and reliable route in tissue engineering technology, particularly in cartilage tissue culture.

Osso liofilizado bovino não-desmineralizado com células-tronco mesenquimais para engenharia tecidual: estudo experimental em sítio heterotópico / Bovine non-demineralized lyophilized bone with mesenchymal stem cells for tissue engineering: experimental study in heterotopic site

Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino não-desmineralizado para engenharia tecidual óssea. Método: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Utilizou-se modelo experimental heterotópico, com a implantação de construtos de osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) no plano subcutâneo no dorso dos animais. Foram organizados 4 grupos de comparação (n=10 animais em cada grupo): 1) OL isoladamente (grupo controle); 2) OL + células mononucleares da medula (CMM); 3) OL + células-tronco mesenquimais (CTM); 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor (CTMdif). A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação, com a observação em todas as amostras de tecido conjuntivo fibroso rico em neovasos estendendo-se por entre as trabéculas ósseas, sem osteoblastos ou osteócitos viáveis e sem neoformação óssea. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre os grupos mostrando p=0,867. Conclusões: Os resultados mostraram que, no modelo estudado e com os métodos utilizados, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Este estudo não confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea, sendo necessários estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, e que explorem separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea.

Objective: To evaluate the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on bovine nondemineralized lyophilized bone scaffolds for bone tissue engineering. Method: Bone marrow cells donors, as well as the receptors of the bone constructs were C57BI/6 isogenic line mice. A heterotopic experimental model was used, with implantation of the constructs into subcutaneous pouches on the backs of the animals. Four comparison groups were set (n=10 animals each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells (MMC); 3) LB + mesenchymal stem cells (MST); 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in osteoinductive medium (MSTdif). The constructs were harvested 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples fibrous connective tissue rich in neovessels was observed extending through bone trabeculae, without viable osteoblasts or osteocytes and without new bone formation. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity have not shown any difference among comparison groups, with the analysis of variance between groups showing p value=0.867. Conclusions: In this experimental model and with the methods used, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone structure did not add osteogenic properties to the material. The initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering could not be confirmed, and further studies are required to assess it in other experimental models, and to explore separately each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Operação de Ross com homoenxertos valvares decelularizados: resultados de médio prazo / Ross Operation with decelularized pulmonary allografts: medium-term results

OBJETIVO: Avaliar os resultados de médio prazo do uso de homoenxertos decelularizados na Operação de Ross. MÉTODOS: Entre janeiro de 2003 e fevereiro de 2007, 68 pacientes foram submetidos à Operação de Ross com homoenxertos decelularizados. Quarenta e oito pacientes eram do sexo masculino, com idade media de 30,3±11,2 anos. A decelularização foi feita com Ácido Deoxicólico (DOA), em 35 casos, e com Dodecilsulfato de Sódio (SDS), em 33. Para a comparação dos gradientes, foram selecionados 68 pacientes pareados pela idade, e que usaram homoenxertos criopreservados. Todos os pacientes realizaram ecocardiograma antes da alta e estão sendo avaliados anualmente. Oito pacientes tiveram controle por ressonância nuclear. Em dois pacientes reoperados, foi possível fazer análise histológica de um segmento do conduto pulmonar. RESULTADOS: Houve um (1,4 por cento) óbito imediato. Na evolução tardia, houve duas reoperações e um óbito. Os gradientes imediatos variaram de 4 a 29mmHg (m=10,3±5,5), e apresentaram elevação para 16,5± 12,2mmHg (min= 4, max = 45) aos 24 meses. Quando comparados com o grupo criopreservado, não houve diferenças significativas. Entretanto, houve tendência a melhores resultados em homoenxertos decelularizados com SDS após 12 meses de evolução. A análise histológica revelou reendotelização e repovoamento parcial da camada média com células autógenas. Não houve insuficiência pulmonar progressiva. Os dados de ressonância magnética demonstraram menor tendência de retração dos condutos decelularizados. CONCLUSÕES: O uso de homoenxertos decelularizados foi seguro, com bons resultados até quatro anos de evolução. Houve tendência a menores gradientes tardios nos homoenxertos decelularizados com SDS após 12 meses.

OBJECTIVE: To evaluate the medium-term results (4 years) of decelularized allografts during Ross Operation. METHODS: From January 2003 to February 2007, 68 patients underwent Ross Operation with decelularized allografts. Forty eight were male and the mean age was 30.3±11.2 years. Decelularization was done with deoxicolic acid (DOA) in 35 cases and with sodium dodecylsulfate (SDS) in 33. For comparison of the gradients, 68 patients with cryopreserved allografts and matched for age were selected. All patients had a control echo before hospital discharge and annually thereafter. In addition, eight patients had MRI studies. In two patients, samples of the conduit wall were analyzed by histological analysis. RESULTS: There was one (1.4 percent) early death. In the late follow-up, there were two reoperations for endocarditis and one late death. The early gradients varied between 4 29 mmHg (m= 10.3± 5.5mmHg) and exhibited an increase to 16.5±12.2 mmHg (min=4, max=45) at 24 months postoperatively. There were no significant differences when compared to the cryopreserved group. There was, however, a tendency towards lesser gradients in the SDS decelularized group after 12 months. Histological analysis revealed partial reendothelization and progressive repopulation of the tunica media with autogenous cells. There was no progressive pulmonary insufficiency. The MRI results showed a lesser tendency to shrinkage in the decelularized conduits. CONCLUSIONS: The use of decelularized allografts was safe and with good medium-term results up to 4 years. There was a tendency to lower late gradients in the SDS decelularized allografts after 12 months.

Implante de proteína morfogenética ósses (rhBMP-2) em arcabouço de osso inorgânico no tecido muscular de rato: avaliação histológica e radiográfica / Bone Morphogenetic Protein´s (rhBMP-2) in bone inorganic scaffold implanted at rat's muscle tissue: histological and radiographic evaluation

No presente trabalho, foi realizada avaliação histológica e radiográfica do implante de proteína morfogenética óssea recombinante humana (rhBMP-2) em arcabouço de osso mineral desnaturado extraído de fêmur de vitelo, em tecido muscularde rato. Dezesseis animais foram anestesiados na porção mediana da tíbia e foi realizada incisão no músculo, no sentido longitudinal, no qual foi implantada rhBMP-2 em arcabouço de osso inorgânico. Decorridos 7, 21, 40 e 112 dias da cirurgia, os animais, em número de quatro para cada período, foram anestesiados, radiografados e removidas a peças contendo os implantes. Os cortes histológicos obtidos após processamento laboratorial foram corados com hematoxilina-eosina para estudo microscópio. Os resultados evidenciaram que, na fase inicial, há formação de processo inflamatório agudo evidenciado pelo exsudato de neutrófilos. Nos períodos finais do experimento, a rhBMP-2 em arcabouço de osso inorgânico estavam parcialmente reabsorvidos - o que pôde ser confirmado com os exames radiográficos -, era notado neovascularização e o tecido muscular circundante apresentava aspecto de normalidade, o que evidenciou a biocompatibilidade dos implantes. A capacidade indutora de diferenciação celular da rhBMP-2 foi inibida.