A fully validated microbiological assay for daptomycin injection and comparison to HPLC method

abstract Daptomycin (DPT) was the first lipopeptide antibiotic available for commercialization. It is active against gram-positive bacteria, including resistant strains. This work aimed to develop and validate a turbidimetric microbiologic assay to determine daptomycin in an injectable form. A 3x3 design was employed, at concentrations of 1, 2 and 4.0 µg/mL. The microorganism test used was Staphylococcus aureus ATCC 6538p, and Antibiotic Medium 3 was used as the culture medium. Method validation demonstrated that the bioassay was linear (r=0.9995), precise (RSD=2.58%), accurate (recovery 100.48± 2.11%), and robust. Degradation kinetics was also performed in an alkaline medium, indicating that daptomycin degradation follows first order kinetics under these conditions. The analyses of degraded solutions showed that daptomycin degradation products do not possess bactericidal activity. The bioassay was compared to HPLC method that was previously developed and no significant difference was found between them (p>0.05). The method proved to be appropriate for daptomycin injection quality control.

resumo A daptomicina (DPT) é o primeiro lipopeptídeo cíclico disponível para comercialização. Possui atividade frente a bactérias gram-positivas, incluindo cepas resistentes. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um ensaio microbiológico turbidimétrico para quantificar a daptomicina na forma injetável. Empregou-se delineamento 3x3, nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µg/mL. Como micro-organismo teste foi usado Staphylococcus aureus ATCC 6538p, e Meio para Antibióticos nº 3 foi empregado como meio de cultura. A validação do método demonstrou que o ensaio foi linear (r=0,9995), preciso (RSD=2,55%), exato (recuperação de 100,48 ± 2,11%) e robusto. A cinética de degradação em meio alcalino foi avaliada, indicando que a daptomicina segue cinética de primeira ordem nessa condição. A análise das soluções degradadas mostrou que os produtos de degradação da daptomicina não possuem atividade antimicrobiana. O bioensaio foi comparado com o método por CLAE previamente desenvolvido e não houve diferença significativa entre ambos (p<0,05). O método mostrou-se apropriado para o controle de qualidade da daptomicina injetável.

Development and validation of a rapid turbidimetric assay to determine the potency of norfloxacin in tablets

Norfloxacin is one of the first commercially available (and most widely used) fluoroquinolone antibiotics. This paper reports the development and validation of a simple, sensitive, accurate and reproducible turbidimetric assay method to quantify norfloxacin in tablets formulations in only 4 hours. The bioassay is based on the inhibitory effect of norfloxacin upon the strain ofStaphylococcus epidermidis ATCC 12228 IAL 2150 used as test microorganism. The assay was performed 3x3 parallel lines like, three tubes for each concentration of reference substance and three tubes for each sample concentration. The results were treated statistically by analysis of variance and were found to be linear (r2 = 0.9999) in the selected range of 25-100 μg mL-1; precise (intra-assay: relative standard deviation (RSD) = 1.33%; inter-assay: RSD = 0.21%), accurate (100.74%) and robust with RSD lower than 4.5%. The student's t-test showed no statistically significant difference between the proposed turbidimetric method and an HPLC method previously validated. However the turbidimetric assay can be used as a valuable alternative methodology for the routine quality control of this medicine, complementary to other physical-chemical methods.

O norfloxacino foi a primeira fluorquinolona (e mais utilizada) disponível no mercado. Este trabalho divulga um novo desenvolvimento e validação de um método turbidimétrico simples, sensível, preciso e reprodutível para a quantificação de norfloxacino em comprimidos em apenas 4 horas. O bioensaio é baseado no efeito inibitório de norfloxacino sobre a cepa Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 IAL 2150, utilizada como micro-organismo teste. O bioensaio foi efetuado através do delineamento de linhas paralelas 3x3, em que três tubos foram utilizados para a solução padrão e três tubos para as concentrações da amostra. Os resultados foram tratados estatisticamente pela análise de variância, apresentando coeficiente de correlação linear der2 = 0,9999, na faixa de 20 a 100 μg mL-1; precisão (intra-ensaio: desvio padrão relativo (RSD) 1,33%; inter-ensaio: RSD=0,21%), exatidão (100,74%) e robustez com RSD menor que 4,5%. O teste-tmostrou não haver diferença estatisticamente significativa entre o método turbidimétrico proposto e um método por HPLC previamente validado. No entanto, o ensaio turbidimétrico pode ser utilizado como método alternativo para o controle de qualidade de rotina para este antimicrobiano, como um complemento de outros métodos físico-químicos.

Development and validation of a microbiological assay for determination of chlorhexidine digluconate in aqueous solution

Chlorhexidine (CHX) is a broad-spectrum antiseptic that is used in many topical pharmaceutical formulations. Because there is no official microbiological assay reported in the literature that is used to quantify CHX, this paper reports the development and validation of a simple, sensitive, accurate and reproducible agar diffusion method for the dosage of chlorhexidine digluconate (CHX-D) in an aqueous solution. The assay is based on the inhibitory effect of CHX-D upon the strain of Staphylococcus aureus ATCC 25923, which is used as the test microorganism. The design 3x3 parallel-line model was used. The results were treated statistically by analysis of variance (ANOVA), and they were excellent in terms of linearity (r = 0.9999), presenting a significant regression between the zone diameter of growth inhibition and the logarithm of the concentration within the range of 0.5 to 4.5%. The results obtained were precise, having relative standard deviations (RSD) for intra-day and inter-day precision of 2.03% and 2.94%, respectively. The accuracy was 99.03%. The method proved to be very useful and appropriate for the microbiological dosage of CHX-D in pharmaceutical formulations; it might also be used for routine drug analysis during quality control in pharmaceutical industries.

Clorexidina (CHX) é um antisséptico com amplo espectro de ação utilizada em muitos tipos de preparações farmacêuticas para uso tópico. Uma vez que não há na literatura ensaio microbiológico oficial para quantificar a clorexidina, este trabalho objetivou o desenvolvimento e validação de um ensaio microbiológico simples, sensível, exato e reprodutível, por difusão em ágar, para doseamento de digliconato de clorexidina (CHX-D) em solução aquosa. O ensaio é baseado no efeito da inibição de Staphylococcus aureus ATCC 25923, utilizado como microorganismo teste, pela CHX-D. Utilizou-se o delineamento 3x3. Os resultados foram verificados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) e apresentaram excelente linearidade (r = 0,9999), demonstrando que o método segue o modelo linear com regressão significativa entre o diâmetro da zona de inibição e o lagaritmo da concentração no intervalo de 0,5 a 4,5%. Os resultados obtidos foram precisos apresentando desvio padrão relativo (DPR) para precisão intra-dia de 2,03% e DPR para precisão inter-dias de 2,94%. A exatidão foi 99,03%. O método provou ser muito útil e apropriado para doseamento microbiológico da CHX-D em formas farmacêuticas e pode ser empregado para análise desta substância no controle de qualidade em indústrias farmacêuticas.

Comparison of microbiological assay and HPLC-UV for determination of fluconazole in capsules / Comparação de ensaios microbiológicos e CLAE-UV para determinação de fluconazol em cápsulas

The development of a specific agar diffusion bioassay for the quantitative determination of fluconazole formulated in capsules was carried out using a strain of Candida albicans ATCC 18804 as the test organism. A prospective validation of the method showed adequate linearity (r²=0.9995), precision (R.S.D. = 4.0 percent for intra-day and 4.5 percent for inter-day precision) and accuracy (mean recovery = 102.9 percent). High performance liquid chromatography was chosen as a comparison method for the fluconazole determination. The contents of fluconazole determined by both methods, for four capsule samples, showed a strong correlation, confirmed by Pearson's correlation coefficient value (r = 0.9884). The bioassay is a suitable method for both research and pharmaceutical industry laboratories.

Este trabalho visou ao desenvolvimento e validação de um método microbiológico por difusão em ágar para quantificação de fluconazol em cápsulas utilizando o isolado Candida albicans ATCC 18804 como reagente biológico. O método foi validado e foi verificada linearidade (r²=0,9995), precisão (D.P.R. = 4.0 por cento para precisão intra-dia e 4,5 por cento para precisão inter-dia) e exatidão (recuperação média = 102,9 por cento). Concomitantemente, foi realizado o doseamento de fluconazol nas cápsulas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. Os teores encontrados por ambos os métodos demonstraram alta correlação, confirmada pelo Coeficiente de Correlação de Pearson (r = 0,9884). O ensaio microbiológico desenvolvido pode ser considerado ferramenta valiosa tanto para a pesquisa científica quanto para a rotina da indústria farmacêutica.