ABSTRACT
ABSTRACT Introduction: Gliomas are characterized by rapid proliferation and aggressive invasion into normal surrounding brain tissue. In medical laboratories, the in vitro wound healing assay stands out as a simple, easy, inexpensive and affordable method to evaluate cell migration and proliferation. Objective: To standardize the in vitro wound healing assay using antimicrotubule drugs as positive controls. Methods: U87MG glioma cells were seeded at different densities and, after 24 h, the monolayer was scratched using different micropipette tip size to create a gap with no cells. The cells were then treated with colchicine and paclitaxel in culture medium with the presence or absence of fetal bovine serum. The wound was photographed with the aid of an inverted microscope and the wound area was measured using the Image J software. Results: Better defined edges scratches and monolayer with approximately 90% confluence were obtained at 1.5 and 2 x 105 cells/well density. The width and area of the scratch were, respectively, 948 pm/2.193221 mm2; 964 pm/2.266 mm2 and 1448 pm/3.221 mm2 to 10. 200 and 1000 pl micropipette tips. Colchicine inhibited wound closure by 12.6% or 3.4%, both in the presence or absence of serum; paclitaxel 2.4 and 6.7% respectively. Conclusion: Under standardized conditions, colchicine and paclitaxel proved to be efficient positive controls into the in vitro wound healing assay.
RESUMEN Introducción: Gliomas se caracterizan por rápida proliferación e invasion agresiva del tejido cerebral normal circundante. En laboratorios médicos, el ensayo de cierre de herida - una prueba in vitro - se destaca por ser un método simple, fácil, de bajo costo y accesiblepara evaluar la migración y la proliferación celular. Objetivo: Estandarizar el ensayo de cierre de herida usando agentes anti-microtúbulos como control positivo. Métodos: Las células de glioma U87MG fueron sembradas en diferentes concentracionesy, después de 24 horas, la monocamadafue rayada con punteras de diferentes tamanos para crear una hendidura sin células. Las células fueron entonces tratadas con colchicina y paclitaxel, en medio con o sin suero fetal bovino. La ranura fue fotografiada con la ayuda de un microscopio invertido, y el área de la ranura fue medida mediante el programa Image J. Resultados: Ranuras con bordes más bien-definidos y monocamada con alrededor de 90% de confluencia se obtuvieron con 1,5 y 2 x 105 células/pozo. La anchura y el área de las ranuras obtenidas fueron, respectivamente, 948 p.m/2,193 mm2; 964p.m/2,266mm2; y 1448p.m/3,221 mm2 para las punteras de 10,200y 1000pl. La colchicina inhibió el cierre de las ranuras en 12,6% o 2,4%, tanto en presencia como en ausencia de suero; el paclitaxel, 3,4% y 6,7%, respectivamente. Conclusión: En condiciones estandarizadas, colchicina y paclitaxel pueden ser usados como control positivo en el ensayo de cierre de herida in vitro.
RESUMO Introdução: Gliomas são caracterizados por terem rápida proliferação e invasão agressiva no tecido cerebral circundante normal. Em laboratórios médicos, o ensaio de ranhura - um teste in vitro - destaca-se por ser um método simples, fácil, barato e acessível para avaliar a migração e a proliferação celular. Objetivo: Padronizar o ensaio de ranhura, utilizando drogas antimicrotúbulos como controles positivos. Métodos: As células de glioma U87MG foram semeadas em diferentes concentrações e, após 24 horas, a monocamada foi arranhada usando ponteiras de diferentes tamanhos para criar uma fenda sem células. As células foram então tratadas com colchicina e paclitaxel, com meio em ausência ou presença de soro fetal bovino. A ranhura foi fotografada com auxílio de microscópio invertido, e a área da ranhura foi medida por meio do programa Image J. Resultados: Ranhuras com bordas mais bem definidas e monocamada com aproximadamente 90% de confluência foram obtidas com 1,5 e 2 x 105 células/poço. A largura e a área das ranhuras obtidasforam, respectivamente, 948pm/2,193 mm2;964pm/2,266mm2; e 1448 pm/3,221 mm2 para as ponteiras de 10, 200 e 1000 pl. A colchicina inibiu o fechamento das ranhuras em 12,6% ou 2,4%, tanto na presença quanto na ausência de soro; o paclitaxel, em 3,4% e 6,7%, respectivamente. Conclusão: Em condições padronizadas, colchicina e paclitaxel podem ser usados como controles positivos eficientes no teste in vitro de ranhura.
ABSTRACT
A nanoemulsão lipídica (LDE) se concentra nas células neoplásicas e pode ser utilizada como transportador de derivado lipofílico da daunorrubicina, como o Noleil- daunorrubicina (oDNR). Neste estudo, a LDE-oDNR foi preparada por homogeneização em alta pressão e sua toxicidade e atividade anti-tumoral testadas. A associação LDE-oDNR teve rendimento elevado e permaneceu estável por longo período. Em camundongosC57BL/6J, a dose máxima tolerada (DMT) foi 65 vezes maior e a DL50 48 vezes maior no tratamento LDE-oDNR comparado ao tratamento DNR comercial, resultando em alta redução da toxicidade. Em camundongos implantados com células de melanoma B16, a preparação LDE-oDNR (7,5 mol/kg) levou a redução de 59 ± 2% do crescimento do tumor comparado a redução de 23 ± 2% para o tratamento DNR comercial na mesma dose (p<0,001). A probabilidade de sobrevida teve aumento pronunciado nos animais tratados com LDE-oDNR comparado à DNR comercial (p <0,01). Além disso, apenas 30% dos animais portadores de melanoma submetidos ao tratamento com LDE-oDNR apresentaram metástases, comparado a 82% quando tratados com DNR comercial. Uma forte redução de toxicidade também foi observada pela redução da anemia e leucopenia nos animais tratados com LDE-oDNR, em comparação com DNR comercial. A preparacao LDE-oDNR foi eficaz também no quadro de trombocitose induzida por tumor. Os testes com fragmentos extraídos de tumores dos animais tratados mostraram que a LDE-oDNR foi mais eficaz na destruição das células neoplásicas comparado ao tratamento DNR comercial (9% de células viáveis com tratamento LDE-oDNR, 27% sob tratamento DNR). O estudo mostrou que o tratamento proposto com o derivado ODNR associado à nanoemulsão (LDE-oDNR) é efetivo no combate às células tumorais, seletivo, menos tóxico e melhor tolerado. Os estudos de farmacocinética e biodistribuição somam a este protocolo informações importantes relacionadas às propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção...
A lipidic nanoemulsion (LDE) that concentrates in neoplastic cells can be used as vehicle to daunorubicin lipophylic derivatives, such as N-oleyl-daunorubicin (oDNR). Here, LDE-oDNR was prepared by high pressure homogenization to test toxicity and anti-tumor activity. LDE-oDNR association yield was high and stable for long period. In mice, maximum tolerated dose was 65 and LD50 was 48-fold greater in LDE-oDNR than in commercial DNR treatment, showing very strong toxicity reduction. In melanoma B16-tumor bearing mice, LDE-oDNR (7.5 mol/Kg) reduced tumorgrowth by of 59±2%, and DNR by only 23±2% at same dose level (p<0.001). Survival was pronouncedly increased in LDE-oDNR compared to DNR treatment (p<0.01). Furthermore, the number of melanoma-bearing mice with metastasis was 30% under LDE-oDNR, compared to 82% under DNR treatment. Strong reduction of toxicity was also observed by reduction of anemia and leucopenia under LDE-oDNR, compared to commercial DNR tumor-induced thrombocytosis was more effective with LDE-oDNR than with DNR. Tests with fragments extracted from tumors of treated animals showed that LDE-oDNR was more effective in killing neoplastic cells than DNR (9% of viable cells under LDE-oDNR; 27% under DNR). The pharmacokinetics and biodistribution studies add important information to this protocol related to the properties of absorption, distribution, metabolism and excretion of the formulation under study compared to free DNR. The remarkable toxicity reduction and increase in pharmacological action supports novel LDE-oDNR as a promising weapon in cancer treatment.