ABSTRACT
Se utilizó la cepa El Pao de encefalitis del este venezolana, aislada en el 2002 (EE VE02 EL PAO) como antígeno, para producir una vacuna inactivada oleosa contra el Virus de la Encefalitis Equina del Este (VEEE) en tres formulaciones, a saber: formulación I (F1): antígeno-fase oleosa; formulación II (F2): antígeno-fase oleosa-medio de mantenimiento y formulación III (F3): antígeno-fase oleosa-antígeno. La suspensión de virus se obtuvo en monocapa de cultivo de células de riñón del mono verde africano. Como inactivante se usó la etilenimina binaria (BEI) con adyuvante incompleto de Freund. Se realizaron pruebas de identidad, carga viral, esterilidad, fisicoquímica, inocuidad, potencia, inmunidad y viabilidad. Todas estas pruebas de control de calidad fueron satisfactorias. Cuando las formulaciones se administraron a cobayos, estimularon títulos de anticuerpos por inhibición de la hemoaglutinación ≥ 20 y de seroneutralización ≥ 40, a los 21 d postvacunación con 1 dosis de 1 mL por vía subcutánea. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) en la detección de anticuerpos entre las formulaciones a los 21 días posvacunación, aunque la F3 presentó mayores títulos, seguida de la F2 y la F1, respectivamente (P<0,01). Los anticuerpos neutralizaron in vitro las cepas virulentas del VEEE, y los cobayos vacunados no desarrollaron viremia ni enfermedad neurológica con el desafío de virus vivo, tanto por vía intracerebral como por vía intraperitoneal, en las pruebas de potencia. Se concluye que la vacuna es segura y provee una excelente protección contra la infección del VEEE.
The Pao of eastern encephalitis venezuelan isolated in 2002 (EE VE02 EL PAO) strain was used as an antigen to produce an inactivated oil vaccine against the Eastern Equine Encephalitis Virus (EEEV) in three formulations, as follows: Formulation I (F1): antigen in oil phase; Formulation II (F2): antigen in oil phase-maintenance medium; and Formulation III (F3): antigen-oil phase-antigen. The virus suspension was obtained from African green monkey kidney monolayer cell cultures. The binary ethylenimine (BEI) was used to inactivate the virus, along with an incomplete Freund´s adjuvant. The following quality control tests were performed: identity, viral load, sterility, physicochemical, safety, potency, immunity, and viability. All these tests were satisfactory. The administration to guinea pigs of a single subcutaneous dose of 1 mL of the formulations, caused stimulated antibody titers by hemagglutination inhibition (≥ 20) and serum neutralization (≥ 40), respectively, at 21 days post-vaccination. No statistically significant differences (P> 0.05) in the detection of antibodies between formulations at 21 days post-vaccination were observed, although F3 had higher titles, followed by F2 and F1, respectively (P<0.01). The antibodies neutralized EEEV virulent strains in vitro and the vaccinated guinea pigs did not develop viremia or neurological disease, when challenged with live virus, both intracerebrally and intraperitoneally in potency tests. It is concluded that the vaccine is safe and provides excellent protection against EEEV infection.
ABSTRACT
Se realizó un estudio molecular de cinco cepas de virus de encefalitis equina del este (VEEE) mediante secuenciación de productos obtenidos en el ensayo de transcriptasa reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, por sus siglas en inglés). Secuencias de ~ 500 pb de la región 3 no traducible del genoma se compararon con secuencias homólogas variantes Sur Americana (SA) y Norte Americana (NA) del complejo VEEE. La cepa EE VE02 EL PAO, con la cual se desarrolló una vacuna inactivada oleosa tuvo más similitud con la cepa EE VE76 EL DELIRIO, seguida por EE VE75 CATATUMBO, EE VE96 MLLANO y EE VE84 TUCACAS respectivamente. La alineación de secuencias entre las cepas típicas reveló diferencias de 2,82 a 8,48 %. En tanto que, la cepa EE VE02 EL PAO difirió en un 8,86 % de la de Perú (EE PE-0,0155 del linaje III) y en un 38,08 % de la de EEUU (EE-PE-6 del linaje I, usada en vacunas comerciales). Los resultados indican que las cepas autóctonas tuvieron más similitud con la cepa SA, que con la NA. Se han identificado cuatro principales linajes en el complejo de VEEE (I-IV). El árbol filogenético evidenció dos clado: uno que agrupa los linajes I-III y el otro, el linaje IV. La mayoría de las secuencias están contenidas en el primer clado que, a su vez, se separa en dos grupos que contienen secuencias del linaje I y secuencias de los linajes II-III y, debido al valor bootstrap alto (99%), los grupos se consideran completamente distintos. Sin embargo, éste no es el caso del grupo que contiene a los linajes II-III porque éstos se separan sólo el 53% de las veces, pero se asume que las cepas venezolanas pertenecen al linaje III dividido en dos subclados: IIIA y IIIB.
A molecular study of five strains of the eastern equine encephalitis virus (EEEV) was conducted by sequencing of products generated using the reverse transcriptase assay, coupled to the polymerase chain reaction (RT-PCR). Sequences of approximately 500 pair of bases from the non-translated 3 region of the genome were compared with homologous sequences of the South American (SA) and North American (NA) variants of the EEEV complex. The EE VE02 EL PAO strain, used to develop an inactivated oil vaccine had most resemblance with the EE VE76 EL DELIRIO strain, followed by the EE VE75 CATATUMBO, the EE VE96 MLLANO and the EE VE84 TUCACAS strains, respectively. The alignment of sequences among typical strains revealed differences of 2.82 and 8.48%, respectively, while the EE VE02 EL PAO strain differed in 8.86% from the Perú strain (EE PE-0.0155, from lineage III) and in 38.08% from the NA strain (EE-PE-6, from lineage I, used in commercial vaccines). The results of the present investigation indicate that the autochthonous strains have more similarly with the SA strain than with the NA strain. Four major lineages (I-IV) in the EEEV complex have been identified. The phylogenetic tree evidenced two clades, one which groups lineages I-III and another, lineage IV. Most of the sequences are contained in the first clade, which at the same time, separates into two groups containing sequences of lineage I and lineages II-III; and, due to the high bootstrap value (99%) the groups are considered completely different. However, this was not the case of the group which enclosed the lineages II and III; because these only separate 53% of the time, but it is assumed that the Venezuelan strains belong to linage III, which diverges into two subclades: IIIA and IIIB.