O papel da flagelina e do sistema de secreção de Escherichia coli enteroinvasora na resposta imune inata dos macrófagos / The role of flagellin and secretion system of enteroinvasive Escherichia coli in the immune response innate macrophages

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) é um dos agentes etiológicos da disenteria bacilar. Seu processo fisiopatológico é desencadeado pela expressão de fatores de virulência, que proporcionam sua invasão e sobrevivência nas células do hospedeiro, ativando o sistema imune inato e adaptativo da mucosa intestinal. Trabalhos recentes têm salientado a importância do sistema de secreção e da flagelina bacteriana como agonista de receptores da imuninade inata dos macrófagos, em especial alguns dos receptores do tipo NLR. Uma vez que esta espécie de E. coli também é capaz de expressar flagelina e fazer a montagem completa do flagelo e do sistema de secreção do tipo III, a nossa proposta foi avaliar o papel da flagelina e do sistema de secreção de EIEC na resposta imune dos macrófagos murinos. Para isso, utilizamos três cepas de EIEC: a cepa selvagem; a cepa mutante no gene responsável pela síntese da flagelina; e a cepa sem o plasmídio de virulência plnv, deficiente no sistema de secreção, para a infecção de macrófagos peritoniais de camundongos C57BI/6, caspase-1-/-, IPAF-/- e ASC-/-. Neste estudo foi possível observar que o escape bacteriano e a morte dos macrófagos infectados por EIEC, assim como a ativação da caspase-1 e posterior secreção de IL-1ß é independente da flagelina bacteriana, mas dependente do sistema de secreção, além disso, a ativação da caspase-1 de macrófagos infectados por EIEC é dependente do receptor IPAF e parcialmente da proteína adaptadora ASC. Assim, no nosso modelo, a ativação da caspase-1 dos macrófagos infectados por EIEC parece estar envolvida com o processamento e secreção de IL-1ß e, possivelmente na secreção de IL-18, mas não na morte celular. No modelo de infecção in vivo, o sistema de secreção bacteriano foi importante para a sobrevivência bacteriana no hospedeiro, assim como para a indução de uma resposta inflamatória no local da infecção. Ainda, a caspase-1 parece ter um papel importante para o controle da infecção in vivo por EIEC, podendo assim contribuir para uma resposta imune protetora do hospedeiro

Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) is one of the etiologic agents responsible for bacillary dysentery. The pathophysiological process induced by this bacteria is triggered by the expression of virulence factors that provide the invasion and survival in host cells, resulting in activation of innate and adaptive immune system present on intestinal mucosa. Recent studies have emphasized the importance of the secretion system and bacterial flagellin as agonist of innate immune receptors present in macrophage, especially NLR (Nod like receptors). Then, our proposal was evaluate the role of flagellin (f1iC) and secretion system of EIEC in the induction of immune response of murine macrophages using the EIEC strains wild type (WT), mutant flagellin gene (f1iC), and a strain deficient in secretion system (DSS) for infection of peritoneal macrophages of C57Bl/6, caspase-1-/-, IPAF-/- and ASC-/-- mice. In this study we observed that the bacterial escape and death of infected macrophages with EIEC, the caspase-1 activation and subsequent IL-1ß secretion is independent of bacterial flagellin, but dependent of secretion system, moreover, the caspase-1 activation in infected macrophages is IPAF-dependent and partially dependent of the adapter protein ASC. Thus, in our model, the caspase-1 activation in EIEC infected macrophages seems to be involved with the processing and secretion of IL-1ß and possibly with the secretion of IL-18, but not involved with cell death. In the infection model in vivo, bacterial secretion system was important for bacterial survival in the host, as well as for the inflammatory response induction at the infection site. In addition, caspase-1 seems to have an important role to the control of in vivo infection by EIEC and can contribute to a protective immune response of the host

Molecular characterization of enteroinvasive Escherichia coli ipa genes by PCR-RFLP analysis

In this study, polymorphism in ipa genes was found in five out of nine EIEC serotypes studied. When SalI and HindII were used in RFLP-PCR assays many EIEC serotypes showed polymorphism in ipaB and ipaD. On the other hand, no polymorphism was observed in ipaA and ipaC in these strains. The polymorphism present in EIEC strains is serotype-dependent, since restriction patterns were conserved amongst strains belonging to the same serotype. When IpaB deduced amino acid sequences of S. flexneri M90T and FBC124-13 were compared, ten amino acids changes could be observed mainly in the amino-terminal region. The deduced EIEC IpaD amino-acid sequence presented 91% similarity with the Shigella strain. In this case, amino acid changes were spread out through the whole structure, except in the carboxyl-terminal region.

No presente estudo, foi encontrado polimorfismo no gene ipa em cinco sorotipos de EIEC, de nove estudados. Quando enzimas de restrição SalI e HindII foram utilizadas no ensaio de PCR-RFLP, amostras de EIEC apresentaram polimorfismo em ipaB e ipaD. Por outro lado, não foram observados polimorfismos nos genes ipaA e ipaC nestas cepas, quando diversas enzimas de restrição foram utilizadas. O polimorfismo presente em cepas de EIEC é sorotipo-dependente, uma vez que os padrões de restrição foram conservados entre as cepas pertencentes ao mesmo sorotipo. Quando a seqüência deduzida de aminoácidos de IpaB de S. flexneri M90T e FBC124-13 foram comparadas, mudanças foram observadas em dez aminoácidos na região amino-terminal. A seqüência deduzida de aminoácidos de IpaD de EIEC apresentou similaridade de 91% com a cepa de Shigella. Neste caso, mudanças de aminoácidos ocorreram em toda a estrutura da molécula de IpaD, exceto na região carboxi-terminal.