Processamento intracelular da fibrilina-1 mutada na síndrome de Marfan: escape do controle de qualidade pela dissulfeto isomerase proteica / Mutated fibrillin-1 intracellular processing in Marfan syndrome: bypass of a protein disulfide isomerase-mediated quality control

A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT...

Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT...

Regulação anômala da autofagia em tecido adiposo na obesidade / Defective regulation of adipose tissue autophagy in obesity

A obesidade e caracterizada pelo acumulo excessivo de gordura no organismo, podendo resultar em dano a saúde. Mudança socioeconômica, ocorrida nos últimos cinquenta anos tem contribuído para o aumento da prevalência da obesidade, a qual e hoje considerada um dos principais problemas de saúde publica no mundo. O acumulo progressivo de ácidos graxos no tecido adiposo, e eventualmente, em outros sítios anatômicos não especializados na estocagem de energia sob a forma de gordura como, por exemplo, o fígado e o músculo, e associado à ativação de uma resposta inflamatória subclinica que desempenha papel importante na indução da resistência a insulina. Esta, por sua vez, e considerada o mecanismo fisiopatogênico unificador de uma serie de doenças comumente associadas à obesidade, tais como o diabetes mellitus, a aterosclerose, a esteatohepatite nao-alcoolica, entre outros. A inflamação subclinica desempenha um papel central na indução da resistência a insulina em obesos. Atualmente o estresse de reticulo endoplasmático e a ativação da sinalização do TLR4 vêm sendo identificados como potenciais mecanismos ativadores da inflamação sub-clinica associada à obesidade. No ambiente intracelular a ativação dos sinais inflamatórios disparados por ambos, estresse de reticulo endoplasmático ou TLR4, podem associar-se, modulando ou sendo modulado por outros eventos. Um desses eventos e a autofagia que se caracteriza como um processo celular finamente regulado e desempenha um papel importante no controle de varias funções da célula, tais como, reciclagem de organelas, disponibilidade de nutrientes e diferenciação celular. Um estudo recente demonstrou a existência de aumento na atividade autofágica em tecido adiposo de pessoas obesas e propôs a associação causal entre autofagia e resistência a insulina. A redução da adiposidade e o mecanismo mais eficiente para reduzir à resistência a insulina em pessoas obesas.

Obesity, defined as abnormal or excessive fat accumulation that may impair life quality, is one of the major public health problems in modern world. It results from an imbalance between food intake and energy expenditure leading to the progressive accumulation of fatty acids in the adipose tissue and in some tissues that are not specialized in energy storage, such as liver and muscle. Insulin resistance is one of the main outcomes of obesity and is regarded as the main mechanism connecting diseases that are commonly associated with obesity, such as, type 2 diabetes mellitus, atherosclerosis, and non-alcoholic steatohepatitis, among others. Subclinical inflammation plays a major role in the induction of insulin resistance in obesity. Recently, endoplasmic reticulum stress and the activation of TLR4 signaling have been identified as potential triggering mechanisms for obesity-associated subclinical inflammation. At the intracellular environment activation of inflammatory signaling triggered by either endoplasmic reticulum stress or TLR4 signaling can integrate and modulate or be modulated by other cellular events. One such event is autophagy which is a highly regulated process that plays an important role in the control of a wide range of cellular functions such as organelle recycling, nutrient availability and tissue differentiation. A recent study has shown an increased autophagic activity in the adipose tissue of obese subjects, and a role for autophagy in obesity associated insulin resistance was proposed. Body mass reduction is the most efficient approach to tackle insulin resistance in over-weight subjects; however, the impact of weight loss in adipose tissue autophagy is unknown. In this study we used a two-step approach to evaluate adipose tissue autophagy during body mass reduction.

Dissulfeto isomerase proteica como via integrativa entre estresse oxidativo e resposta a proteínas mal-enoveladas na reparação à lesão vascular / Protein disulfide isomerase as an integrative way between oxidative stress and unfolded protein response during vascular repair to injury

O remodelamento vascular é um determinante fundamental do lúmen em doenças vasculares, porém os mecanismos envolvidos não estão completamente elucidados. Nós investigamos o papel da chaperona redox residente do retículo endoplasmático Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) e sua fração localizada na superfície celular (peri/epicelular=pecPDI) no calibre e arquitetura vascular durante reparação à lesão. Em artérias ilíacas de coelho submetidas à lesão in vivo, houve importante aumento do mRNA e expressão proteica (~25x aumento 14 dias pós-lesão vs. controle) da PDI. O silenciamento da PDI por siRNA (cultura de órgãos) acentuou o estresse do retículo e apoptose, diferentemente da inibição da pecPDI com anticorpo neutralizante (PDI Ab). Bloqueio in vivo da pecPDI por aplicação de gel perivascular contendo PDI Ab no 12° dia após lesão, com análise após 48 h, promoveu ca.25% redução no calibre vascular analisado por arteriografia e diminuição similar na área total do vaso detectada por tomografia de coerência óptica. Neste processo, não ocorreu alteração no tamanho da neoíntima, indicando assim, que PDI Ab acentuou remodelamento constrictivo. Neutralização da pecPDI promoveu importantes alterações na arquitetura da matriz de colágeno e citoesqueleto, resultando em fibras com orientação invertida e desorganizadas. Diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio e óxidos de nitrogênio também ocorreu. Análise de propriedades viscoelásticas nas artérias indicou redução na ductilidade vascular, evidenciada pela menor distância para ruptura. As alterações subcelulares no citoesqueleto observadas in vivo após PDI Ab foram recapituladas em um modelo de estiramento cíclico em células musculares lisas vasculares, com importante redução na formação das fibras de estresse. Em modelo de migração randômica de células musculares lisas, a exposição a PDI Ab reduziu a resiliência de regulação da polaridade. Embora a neutralização da pecPDI não tenha afetado a atividade...

Whole-vessel remodeling is a critical lumen caliber determinant in vascular disease, but underlying mechanisms are poorly understood. We investigated the role of endoplasmic reticulum chaperone Protein Disulfide Isomerase(PDI) and cell-surface PDI(peri/epicellular=pecPDI) pool in vascular caliber and architecture during vascular repair after injury(AI). After rabbit iliac artery balloon injury, there was marked increase in PDI mRNA and protein (25-fold vs. basal at day 14AI), with increase in both intracellular and pecPDI. Silencing PDI by siRNA (organ culture) induced ER stress augmentation and apoptosis, contrarily to pecPDI neutralization with PDI-antibody(PDI Ab). PecPDI neutralization in vivo with PDIAb-containing perivascular gel from days 12-14AI promoted ca.25% decrease in vascular caliber at arteriography and similar decreases in total vessel circumference at optical coherence tomography, without changing neointima, indicating increased constrictive remodeling. PecPDI neutralization promoted marked changes in collagen and cytoskeleton architecture, with inverted fiber orientation and disorganization. Decreased ROS and nitrogen oxide production also occurred. Viscoelastic artery properties assessment showed decreased ductility, evidenced by decreased distance to rupture. Subcellular cytoskeletal disruption by PDI Ab was recapitulated in vascular smooth muscle cell stretch model, with marked decrease in stress fiber buildup. Also, PDI Ab incubation promoted decreased regulation resilience of vascular smooth muscle migration properties. While pecPDI neutralization did not affect global RhoA activity, there was altered RhoA redistribution to the cell surface and association with caveolin-containing clusters, which mislocalized after stretch. In human coronary atheromas, PDI expression inversely correlated with constrictive remodeling. Thus, strongly-expressed PDI after injury reshapes matrix and cytoskeleton architecture to support an...

Aspectos fisiológicos do cálcio e sua disfunção em patologias neurodegenerativas / Physiological aspects of calcium and its dysfunction in neurodegenerative diseases

O íon cálcio funciona como um segundo mensageiro que regula um amplo espectro de processos celulares. A diminuição ou perda do controle dos mecanismos que regulam a concentração intracelular desse íon está associada, respectivamente, ao envelhecimento dos neurônios e a doenças neurodegenerativas. A gênese dessas modificações é desconhecida. Entretanto, estudos recentes apontam para uma provável correlação entre expressão gênica alterada, estresse do retículo endoplasmático e os processos patológicos associados à disfunção na concentração intracelular de cálcio. O esclarecimento dessas questões poderá trazer novos alvos terapêuticos capazes de frear ou reverter tais alterações, combatendo, dessa forma, tanto o envelhecimento neuronal quanto as doenças neurodegenerativas.

Calcium is a second messenger that regulates a lot of cellular functions. The following mechanisms regulate the intracellular concentrations of the ion: influx, release, extrusion and storage. Decrease or loss in control of these mechanisms is related to aging of neurons and neurodegenerative diseases, respectively. The genesis of these alterations is unknown. However, recent studies point to a correlation between calcium dysfunction and altered gene expression. There is also a correlation between endoplasmic reticulum stress and pathological processes. Further investigations may reveal new therapeutical targets that can block or revert these alterations.

Mediators and mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 diabetes

Type 1 diabetes mellitus (T1D) is characterized by severe insulin deficiency resulting from chronic and progressive destruction of pancreatic beta-cells by the immune system. The triggering of autoimmunity against the beta-cells is probably caused by environmental agent(s) acting in the context of a predisposing genetic background. Once activated, the immune cells invade the islets and mediate their deleterious effects on beta-cells via mechanisms such as Fas/FasL, perforin/granzyme, reactive oxygen and nitrogen species and pro-inflammatory cytokines. Binding of cytokines to their receptors on the beta-cells activates MAP-kinases and the transcription factors STAT-1 and NFkappa-B, provoking functional impairment, endoplasmic reticulum stress and ultimately apoptosis. This review discusses the potential mediators and mechanisms leading to beta-cell destruction in T1D.

O diabetes melito tipo 1 (DM1) tem como característica uma grave deficiência de insulina que resulta da destruição da célula-beta, crônica e progressiva, pelo sistema imune. O desencadeamento da autoimunidade contra a célula-beta é causado, provavelmente, por agentes ambientais que atuam quando existe predisposição genética. Uma vez ativadas, células imunes invadem as ilhotas, e os efeitos deletérios sobre as células-beta são mediados por mecanismos relacionados a Fas/FasL, perforina/granzima, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, e a citocinas pró-inflamatórias. A ligação de citocinas a seus receptores na célula-beta ativa MAP-quinase e fatores de transcrição STAT-1 e NFkapaB, provocando prejuízo funcional, estresse de retículo endoplasmático e, por fim, apoptose. Esta revisão discute os mecanismos e os mediadores potenciais que levam à destruição da célula-beta no DM1.