Characterization of glutamine synthetase from the ammonium-excreting strain HM053 of Azospirillum brasilense / Caracterização da glutamina sintetase da estipe excretora de amônio HM053 de Azospirillum brasilense

Glutamine synthetase (GS), encoded by glnA, catalyzes the conversion of L-glutamate and ammonium to L-glutamine. This ATP hydrolysis driven process is the main nitrogen assimilation pathway in the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense. The A. brasilense strain HM053 has poor GS activity and leaks ammonium into the medium under nitrogen fixing conditions. In this work, the glnA genes of the wild type and HM053 strains were cloned into pET28a, sequenced and overexpressed in E. coli. The GS enzyme was purified by affinity chromatography and characterized. The GS of HM053 strain carries a P347L substitution, which results in low enzyme activity and rendered the enzyme insensitive to adenylylation by the adenilyltransferase GlnE.

A glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, catalisa a conversão de L-glutamato e amônio em L-glutamina. Este processo dependente da hidrólise de ATP é a principal via de assimilação de nitrogênio na bactéria fixadora de nitrogênio Azospirillum brasilense. A estirpe HM053 de A. brasilense possui baixa atividade GS e excreta amônio no meio sob condições de fixação de nitrogênio. Neste trabalho, os genes glnA das estirpes do tipo selvagem e HM053 foram clonados em pET28a, sequenciados e superexpressos em E. coli. A enzima GS foi purificada por cromatografia de afinidade e caracterizada. A GS da estirpe HM053 possui uma substituição P347L que resulta em baixa atividade enzimática e torna a enzima insensível à adenililação pela adenililtransferase GlnE.

Characterization of glutamine synthetase from the ammonium-excreting strain HM053 of Azospirillum brasilense

Abstract Glutamine synthetase (GS), encoded by glnA, catalyzes the conversion of L-glutamate and ammonium to L-glutamine. This ATP hydrolysis driven process is the main nitrogen assimilation pathway in the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense. The A. brasilense strain HM053 has poor GS activity and leaks ammonium into the medium under nitrogen fixing conditions. In this work, the glnA genes of the wild type and HM053 strains were cloned into pET28a, sequenced and overexpressed in E. coli. The GS enzyme was purified by affinity chromatography and characterized. The GS of HM053 strain carries a P347L substitution, which results in low enzyme activity and rendered the enzyme insensitive to adenylylation by the adenilyltransferase GlnE.

Resumo A glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, catalisa a conversão de L-glutamato e amônio em L-glutamina. Este processo dependente da hidrólise de ATP é a principal via de assimilação de nitrogênio na bactéria fixadora de nitrogênio Azospirillum brasilense. A estirpe HM053 de A. brasilense possui baixa atividade GS e excreta amônio no meio sob condições de fixação de nitrogênio. Neste trabalho, os genes glnA das estirpes do tipo selvagem e HM053 foram clonados em pET28a, sequenciados e superexpressos em E. coli. A enzima GS foi purificada por cromatografia de afinidade e caracterizada. A GS da estirpe HM053 possui uma substituição P347L que resulta em baixa atividade enzimática e torna a enzima insensível à adenililação pela adenililtransferase GlnE.

Characterization of glutamine synthetase from the ammonium-excreting strain HM053 of Azospirillum brasilense / Caracterização da glutamina sintetase da estipe excretora de amônio HM053 de Azospirillum brasilense

Glutamine synthetase (GS), encoded by glnA, catalyzes the conversion of L-glutamate and ammonium to L-glutamine. This ATP hydrolysis driven process is the main nitrogen assimilation pathway in the nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense. The A. brasilense strain HM053 has poor GS activity and leaks ammonium into the medium under nitrogen fixing conditions. In this work, the glnA genes of the wild type and HM053 strains were cloned into pET28a, sequenced and overexpressed in E. coli. The GS enzyme was purified by affinity chromatography and characterized. The GS of HM053 strain carries a P347L substitution, which results in low enzyme activity and rendered the enzyme insensitive to adenylylation by the adenilyltransferase GlnE.

A glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, catalisa a conversão de L-glutamato e amônio em L-glutamina. Este processo dependente da hidrólise de ATP é a principal via de assimilação de nitrogênio na bactéria fixadora de nitrogênio Azospirillum brasilense. A estirpe HM053 de A. brasilense possui baixa atividade GS e excreta amônio no meio sob condições de fixação de nitrogênio. Neste trabalho, os genes glnA das estirpes do tipo selvagem e HM053 foram clonados em pET28a, sequenciados e superexpressos em E. coli. A enzima GS foi purificada por cromatografia de afinidade e caracterizada. A GS da estirpe HM053 possui uma substituição P347L que resulta em baixa atividade enzimática e torna a enzima insensível à adenililação pela adenililtransferase GlnE.

Evaluation of three methods for preservation of Azotobacter chroococcum and Azotobacter vinelandii

La preservación de bacterias es asunto de granimportancia debido a que muchas de ellas son usadas enprocesos biotecnológicos que requieren mantener su viabilidad ypropiedades genéticas. En este estudio, se evaluaron tres métodospara la preservación de A. chroococcum C26 y A. vinelandii C27;criopreservación, liofilización, e inmovilización en polímerossecos, durante 60, 30 y 60 días, respectivamente. A su vez, seestudió el efecto de tres agentes protectivos para la liofilizacióny para la criopreservación y cuatro polímeros. La eficiencia delos métodos fue evaluada contando células viables y midiendoactividad como fijación de nitrógeno. Los resultados mostraronque la mejor técnica, la cual mantuvo la viabilidad y la actividad,fue la liofilización, seguida por inmovilización y criopreservación.La liofilización mantuvo estable la habilidad bacteriana para fijarnitrógeno, la tasa de sobrevivencia bacteriana (TSB) fue superioral 80%; y el mejor resultado se evidenció cuando se usó S/BSAcomo agente protectivo. La inmovilización mantuvo la BSRsuperior al 80%, y la fijación de nitrógeno fue disminuida en 20%.La criopreservación tuvo pérdida sustancial de viabilidad para C26(TSB aprox. 70%); mientras que C27 se preservó bien. La fijaciónde nitrógeno fue significativamente disminuida para ambas cepasindependientemente del agente crioprotectivo usado (P < 0.05).Los resultados sugieren que el éxito de los métodos de preservaciónpara Azotobacter depende de la técnica, el agente protectivo y la cepausada; siendo la liofilización con S/BSA la técnica con mejoresresultados para preservar las bacterias de este género...

Because the use of bacteria for biotechnological processes requires maintaining their viability and geneticstability, preserving them becomes essential. Here, we evaluated three preservation methods for A.chroococcum C26 and A. vinelandii C27; preservation methods: cryopreservation and immobilization in drypolymers for 60 days, and freeze-drying for 30. We evaluated their efficiency by counting viable cells andmeasuring nitrogen fixation activity. Additionally, we assessed the effect of three protective agents forfreeze-drying, three for cryopreservation, and four polymers. Freeze-drying proved the best technique tomaintain viability and activity, followed by immobilization and cryopreservation. Bacterial nitrogen fixingability remained unchanged using the freeze-drying method, and bacterial survival exceeded 80%; S/BSAwas the best protective agent. Immobilization maintained bacterial survival over 80%, but nitrogen fixationwas decreased by 20%. Lastly, cryopreservation resulted in a dramatic loss of viability for C26 (BSRapprox. 70%), whereas C27 was well preserved. Nitrogen fixation for both strains decreased regardless ofthe cryoprotective agent used (P < 0.05). In conclusion, the success of Azotobacter preservation methodsdepend on the technique, the protective agent, and the strain used. Our results also indicated that freezedryingusing S/BSA is the best technique to preserve bacteria of this genus...

Porque o uso de bactérias para processos biotecnológicos,requer a manutenção da sua viabilidade e estabilidade genética,preserva-las é essencial Avaliaram-se três métodos de preservação deA. chroococcum C26 e A. vinelandii C27; criopreservação, liofilização, eimobilização de polímeros secos. Examinamos também o efeito deagentes protetores para liofilizar, para a criopreservação, e polímeros.A eficiência foi avaliada contando as células viáveis e medindoa atividade como a fixação do azoto. Os resultados mostraramque a melhor técnica foi a liofilização seguida de imobilização ecriopreservação. A liofilização manteve inalterada a capacidadeda bactéria para fixar o azoto, e o melhor resultado foi observadoquando se usou S/BSA como agente protetor. A criopreservaçãoresultou em uma perda dramática de viabilidade para C26 (TSBaprox. 70%.), enquanto que C27 foi bem preservada. A fixaçãode azoto foi significativamente diminuída para ambas as estirpes,independentemente do agente crioprotector utilizado (P < 0.05).Em conclusão, os resultados sugerem que o êxito dos métodosde conservação de Azotobacter dependem da técnica, do agente deproteção, e da estirpe utilizada, sendo a liofilizacao com S/BSA amelhor técnica para preservar as bactérias deste género...

Variabilidade genética de bactérias diazotróficas associadas a plantas de cana-de-açúcar capazes de solubilizar fosfato inorgânico / Genetic variability of sugarcane-associated diazotrophic bacteria capable of inorganic phosphate solubilizing

A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância agrícola, nacional e mundial, requerendo grandes quantidades de fertilizantes nitrogenados e fosfatados. Além disso, apresenta associação com bactérias que podem promover o desenvolvimento vegetal. O objetivo deste trabalho foi selecionar bactérias diazotróficas, associadas a plantas de cana-de-açúcar, capazes de solubilizar fosfato inorgânico e avaliar a variabilidade genética bacteriana. Para tanto, foram avaliadas 68 linhagens bacterianas diazotróficas, endofíticas de folha e raiz e do rizoplano, de plantas de três variedades de cana-de-açúcar. A seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico foi realizada em meio sólido suplementado com fosfato insolúvel, sendo avaliado o índice de solubilização. A análise da variabilidade genética foi realizada pela técnica de BOX-PCR. Os resultados revelaram que 74% das linhagens diazotróficas foram capazes de solubilizar fosfato, apresentando índices de solubilização diferentes. Foi observado que o tecido vegetal e a variedade de cana influenciaram a interação entre bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato e plantas de cana. O BOX-PCR revelou alta variabilidade genética entre as linhagens analisadas. Logo, conclui-se que as bactérias diazotróficas associadas a plantas de cana-deaçúcar avaliadas expressam a capacidade de solubilizar fosfato inorgânico e que algumas bactérias avaliadas pela técnica de BOX-PCR apresentam alta variabilidade genética.

The sugarcane is a culture of great importance for the Brazilian agriculture. Every year this culture consumes great amounts of nitrogen and phosphate fertilizers. However, the use of plant growth-promoting bacteria can reduce the use of the chemical fertilizers, contributing to the economy and the environment conservation. So, the goal of this study was to select sugarcane-associated diazotrophic bacteria able to solubilize inorganic phosphate and to evaluate the genetic diversity of these bacteria. A total of 68 diazotrophic bacteria, leaf and root endophytic and rizoplane, of three sugarcane varieties. The selection of inorganic phosphate solubilizing diazotrophic bacteria was assayed by the solubilization index (SI) in solid medium containing insoluble phosphate. The genetic variability was analyzed by the BOX-PCR technique. The results showed that 74% of the diazotrophic strains were able to solubilize inorganic phosphate, presenting classes of different SI. The results showed that the vegetal tissue and the genotype plant influenced in the interaction between phosphate solubilizing diazotrophic bacteria and sugarcane plants. BOX-PCR revealed high genetic variability among the strains analyzed. So, sugarcane-associated diazotrophic bacteria express the capacity to solubilize inorganic phosphate and they present high genetic diversity.

Resposta da co-inoculação de bactérias promotoras de crescimento em plantas e Bradyrhizobium sp. em caupi / Co-inoculation response of growth promoting bacterias in plants and Bradyrhizobium sp. in cowpea

Para a região árida e semi-árida do Nordeste brasileiro, o cultivo do caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp.) vem se destacando por ser uma cultura adaptável as condições da região. Devido à capacidade do caupi de, em simbiose com o rizóbio, realizar a FBN, a co-inoculação rizóbio e bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCP's) poderá optimizar a fixação do N2 atmosférico dependendo da combinação e compatibilidade das estirpes envolvidas. O objetivo do trabalho foi avaliar a resposta da co-inoculação de BPCP's e Bradyrhizobium sp. como alternativa para optimizar a performance simbiótica e o desenvolvimento do caupi em condições de casa-de-vegetação. O experimento foi instalado em casa de vegetação, utilizando como substrato areia lavada e autoclavada em vasos de Leonard. Os tratamentos foram: 22 estirpes de BPCP's comparadas com a estirpe padrão (BR 3267), no caupi cv. "IPA 206". A colheita foi efetuada aos 35 dias após o plantio (DAP) e foram avaliados as seguintes variáveis: altura de planta (AP) aos 15, 25 e 35 dias, comprimento da raiz (CR), matéria seca da parte aérea (MSPA), matéria seca da raiz (MSR), matéria seca do nódulo (MSN), nodulação específica (NE) e nitrogênio acumulado na parte aérea (Nac). Os resultados mostram que a cultura do caupi respondeu significativamente a inoculação de estirpes de Bacillus, Brevibacillus e Paenibacillus co-inoculados com a estirpe de Bradyrhizobium sp. (BR 3267). A interação dos micro-organismos estudados não influenciou as variáveis, nodulação específica e matéria seca dos nódulos no caupi cv. IPA 206. A estirpe de Paenibacillus graminis (MC 04.21) co-inoculada com Bradyrhizobium sp. (BR 3267) foi superior em relação às demais estirpes avaliadas na produção de nitrogênio acumulado na matéria seca da parte aérea, proporcionando uma melhor performance simbiótica.

In the arid and semi-arid northeastern Brazil, the cultivation of cowpea has stood out for being an adaptable culture conditions in the region. Because of the ability of cowpea, in symbiosis with rhizobia carry out the FBN, the co-inoculation Rhizobium and growth promoting bacteria in plants can optimize the fixation of atmospheric N2 depending on the combination and compatibility of the strains involved. The objective of this study was to evaluate the response of the inoculation BPCP's and Bradyrhizobium sp. as an alternative to optimize performance and development of symbiotic cowpea under conditions of green-house. The experiment was conducted in a greenhouse, using as substrate washed and sterilized sand in Leonard jars. The treatments were: 22 strains BPCP's compared with the strain (BR 3267), on cowpea cv. IPA 206. At harvest 35 days after planting (DAP) and the following variables were evaluated: plant height (AP) 15, 25 and 35 days, root length (CR), shoot dry matter (MSPA), root dry matter (MSR), nodule dry matter (MSN), specific nodulation (NE) and nitrogen accumulated in shoots (Nac). The results show that the culture of cowpea responded significantly to inoculation of strains of Bacillus, Brevibacillus and Paenibacillus co-inoculated with the strain of Bradyrhizobium sp. (BR 3267). The interaction of microorganisms studied non-influenced the variables specific nodulation and dry matter of nodules in cowpea cv. IPA 206. The strain of Paenibacillus graminis (MC 04/21) coinoculated with Bradyrhizobium sp. (BR 3267) was higher compared to other strains tested in the production of nitrogen accumulated in shoot dry matter, providing a better performance symbiotic.

Bactérias endofíticas como agentes promotores do crescimento de plantas de tomateiro e de inibição in vitro de Ralstonia solanacearum / Endophytic bacteria as agents of plant growth promotion in tomato and inhibition in vitro of Ralstonia solanacearum

A partir de 150 isolados de bactérias endofíticas obtidos de folhas, caules e raízes de tomateiros sadios, 53 destacaram-se quanto à habilidade em promover o crescimento de plantas de tomateiro (Solanum lycopersicum L.). Submetidos a uma nova seleção, os isolados UFV-E17, UFV-E22, UFV-E25, UFV-E26, UFV-E27, Bacillus cereus (UFV-E29), UFV-E49, UFLA 06-LS, UFLA 08-LS e UFLA 11-LS apresentaram maior promoção do crescimento. Avaliações semanais de altura e número de folhas e folíolos das plantas aconteceram durante 45 dias. Após a sexta avaliação, mensurou-se a área foliar e o peso da matéria fresca e seca da parte aérea e da raiz das plantas. O isolado UFV-E49 apresentou melhor resultado para altura, área foliar, número de folhas e peso da matéria fresca e seca, tanto da parte aérea quanto da raiz. Dos isolados selecionados, somente dois apresentaram efeito inibitório direto in vitro a Ralstonia solanacearum.

Out of one hundred and fifty isolates of endophytic bacteria from leaves, stems and roots of healthy tomatoes (Solanum lycopersicum L.), fifty three showed ability to promote tomato plant growth, among these, ten isolates UFV-E17, UFV-E22, UFV-E25, UFV-E26, UFV-E27, Bacillus cereus (UFV-E29), UFV-E49, UFLA 06-LS, UFLA 08-LS and UFLA 11-LS, provided the largest plant growth promotion. Weekly assessment of plant height and number of leaves and leaflets were carried out during 45 days. After the sixth evaluation, the leaf area and the fresh and dry weight of the aerial part of plants and of the roots were measured. Isolate UFV-E49 provided the largest values of height, leaf area, number of leaves and fresh and dry weight of the aerial part of plants as well as the root. From the selected isolates, only two presented antimicrobial activity against Ralstonia solanacearum.

Capacidade de nodulação de cem leguminosas da amazônia

This paper includes informations about nodulation capacity of 100 native species of the legume family from the states of Amazonas, Pará, Rondônia and Roraima (Brasil), evaluated in their original habitats and/or in nursery plots. Field observations were made in "terra-firme" forests, várzea, campinarana, savana, igapó, secondary forest, etc. Plant material was collected in a total of 11 habitats. The species were studied in nursery beds using soils from diferent regions. The genera and species of plants were identified at the INPA herbarium. The survey verified that 63% of the species presented nodules. These characteristics were observed in acid soils with different textures and fertility levels, with a pH varying from 3.9 to 5.9. Nodulation was more frequent in species of the sub-families Mimosoideae and Faboideae, than in Caesalpinioideae. The nodules collected had a great variability in colorand shape, being more common coral shapes and creamycolor. Data for nodulation of 21 legume species included 2 new genera not reported before: Acosmium(Faboideae) and Zollemia(Caesalpinioideae). Eleven species, which were tested for the first time, did not show nodulation. Habitat, type of plant growth, soil texture and low fertility had no effect on nodulation, which is considered to be related with other factors like properties inherent to the species and occurrence of compatible rhizobium strains in the different sites.

Neste trabalho são apresentadas informações sobre a habilidade nodulífera de 100 espécies da família Leguminosae, nativas dos estados do Amazonas, Pará, Rondônia e Roraima (Brasil), e avaliadas em seus habitats de origem e/ou em viveiro. As observações foram efetuadas em mata primária, várzea, campinarana, igapó, savana, floresta secundária, etc, totalizando 11 habitats visitados. Foram também, efetuados estudos de comportamento de mudas em viveiro, em diferentes solos da região. A identificação das espécies foi processada no herbário do INPA. Foi constatado que 63% das espécies foram capazes de nodular, sendo esta característica detectada em solos ácidos com diferentes texturas e fertilidades, com pH variando entre 3.9 e 5.9. A nodulação foi mais frequente em espécies das sub-famílias Mimosoideae e Faboideae do que em Caesalpinioideae. Os nódulos encontrados apresentaram uma grande variabilidade de cor e formas, predominando os coralóides de cor creme. Foi observada pela primeira vez a nodulação em 21 espécies, e dentre elas 2 novos gêneros são apresentados como nodulíferos: Acosmium(Faboideae) e Zollernia(Caesalpinioideae). são apresentadas também, novas descrições de í I espécies que não apresentaram nódulos. O habitat, hábito de crescimento da planta, textura e fertilidade do solo, não interferiram na ocorrência da nodulação que foi relacionada a outros fatores como a propriedade intrínseca das espécies, e ocorrência de estirpes de rizóbio compatíveis em cada local.