ABSTRACT
Introducción. Los venenos de serpientes representan una fuente importante de proteínas y péptidos, los cuales exhiben diversas actividades biológicas, tales como antibacterianas, antiparasitarias, antivi-rales, antitumorales, antifúngicas y contra la agregación plaquetaria, entre otras.Las fosfolipasas A2 presentes en los venenos de serpientes son las proteínas más estudiadas en estos modelos. Se ha demostrado que las fosfolipasas A2, activas e inactivas, poseen actividad catalítica contra células tumorales. Objetivo. Aislar, purificar y caracterizar la fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus cumanensis para evaluar su actividad antitumoral in vitro. Materiales y métodos. El aislamiento, la purificación y la identificación de la crotoxina B se hizo mediante la cromatografía de exclusión molecular, la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) y la espectrometría de masas. El efecto citotóxico sobre células tumorales (K562) y células normales (células mononucleares de sangre periférica) se determinó utilizando la técnica de MTT. Resultados. La separación y posterior identificación de la crotoxina B del veneno de C. d. cumanensis de Colombia, permitieron evidenciar que esta fosfolipasa A2 posee efecto citotóxico sobre las células mononucleares de sangre periférica con una dosis de 18,23 ± 0,57 µg/ml, mientras que, para las células K562, fue de 2,34 ± 0,199 µg/ml. Conclusiones. Los resultados sugieren la posibilidad de utilizar la crotoxina B aislada del veneno de C. d. cumanensis como un posible recurso terapéutico para su aplicación en humanos.
Introduction. Snake venoms are an important source of proteins and peptides, which display various biological activities such as antibacterial, antiparasitic, antiviral, antitumor, antifungal and against platelet aggregation, among others.Phospholipases A2 present in snake venoms are the most studied proteins in these models. Active and inactive A2 phospholipases have been shown to possess catalytic activity against tumor cells. Objective. To isolate, purify and characterize the phospholipase A2 of the venom of Crotalus durissus cumanensis to evaluate its in vitro antitumor activity. Materials and methods. Isolation, purification and identification of crotoxin B was done with Size Exclusion Chromatography, Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC, and Mass Spectrometry. The cytotoxic effect on tumor cells (K562) and normal cells (peripheral blood mononuclear cells) was determined using the MTT technique. Results. The separation and subsequent identification of crotoxin B, found in the venom of C. d. cumanensis from Colombia, showed that this phospholipase A2 has a cytotoxic effect on peripheral blood mononuclear cells at a dose of 18.23 ± 0.57 µg / ml, whereas for K562 cells, it was 2.34 ± 0.199 µg/ml Conclusions. The results suggest the use of crotoxin B, isolated from the venom of C. d. cumanensis, as a possible therapeutic resource for human application.
Introdução. Os venenos da serpentes constituem uma importante fonte de proteínas e péptidos, os quais exibem várias actividades biológicas, tais como agentes antibacterianos, antiparasitárias, antivi-rais, antitumorais, antifúngicas e contra a agregação de plaquetas, entre outros. As fosfolipases A2 presentes no veneno da serpentes são as proteínas mais estudadas nestes modelos. Tem sido demostrado que as fosfolipases A2, activas e inactivas, possuem actividade catalítica contra células tumorais. Objetivo. Isolar, purificar e caracterizar a fosfolipase A2 do veneno da Crotalus durissus cumanensis para avaliar a sua actividade anti-umoral in vitro. Materiais e métodos. O isolamento, a purificação e identificação da crotoxina B foi realizada por cromatografia de exclusão molecular, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) e espectrometria de massa. O efeito cito-tóxico sobre células tumorais (K562) e células normais (células mononucleares do sangue periférico) foi determinada usando a técnica de MTT. Resultados. A Separação e subsequente identificação da crotoxina B do veneno da C. d. cumanensis da Colômbia, permitiu constatar que esta fosfolipase A2 tem um efeito citotóxico em células mono-nucleares de sangue periférico, com uma dose de 18,23 ± 0,57 µg/ ml, enquanto que para as células K562, foi 2,34 ± 0,199 ug/ml. Conclusões. Os resultados sugerem a possibilidade de utilizar crotoxina B isolada a partir do veneno da C. d. cumanensis como recurso para o potencial uso terapêutico em humanos.
Subject(s)
Animals , Crotalus , Crotoxin , Cytotoxicity, Immunologic , Phospholipases A2ABSTRACT
Bothrops atrox (jararaca-do-norte) é a principal causa de envenenamento ofídico na região amazônica. Vários estudos têm investigado a bioquímica desta peçonha, bem como os efeitos locais (dor, edema, hemorragia e mionecrose) que ela causa. Por outro lado, os efeitos sistêmicos têm sido menos estudados. Neste trabalho, investigamos as alterações hemodinâmicas causadas por esta peçonha em ratos anestesiados bem como os possíveis mediadores envolvidas nestas respostas. Métodos: Ratos machos Wistar (300-400 g) anestesiados com isoflurano foram canulados para o registro da pressão arterial (carótida) e para a administração intravenosa (i.v.) de diferentes substâncias (peçonha, antagonistas e inibidores) (veia femoral esquerda). Em alguns experimentos, houve administração intramuscular (i.m.) de peçonha. A frequência respiratória foi determinada manualmente e o ECG foi monitorado via eletrodos introduzidos nas patas dianteiras e traseira. Em intervalos pré-estabelecidos, foram coletadas amostras de sangue arterial para análise bioquímica e determinação da cinética da peçonha. Ao término dos experimentos, foram coletados tecidos (rim, pulmão, coração, fígado e músculo) para análise histológica. A capacidade do antiveneno botrópico comercial em neutralizar algumas atividades enzimáticas e as alterações hemodinâmicas foi avaliada pré-incubando-se a peçonha com antiveneno antes de testar a atividade residual. A peçonha também foi fracionada por gel filtração e os picos testados quanto à sua atividade sobre a pressão arterial. Resultados: A peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) causou hipotensão imediata (máxima aos 5 min) seguida por recuperação nos 20 min seguintes; não houve alteração na frequência cardíaca, ECG ou frequência respiratória, e não houve mortes (sobrevida até o final do experimento: 120 min). Uma dose maior (0,7 mg/kg, i.v.) causou hipotensão progressiva, bradicardia e falência respiratória, com morte de todos os ratos (n=6) em 20±4 min. A administração intramuscular (músculo gastrocnêmio) de peçonha (4 mg/kg) mostrou um perfil hemodinâmico semelhante àquele observado com a dose menor i.v. A análise histológica mostrou que a dose menor i.v. causou trombose e hemorragia pulmonares, além de dano renal (descamação epitelial, deposição proteica e microaneurismos); houve proteinúria e hemoglobinúria em urina coletada no final do experimento. Não houve alteração histológica nos outros tecidos examinados (fígado, coração)...(AU)
Bothrops atrox (jararaca-do-norte) is the main cause of snakebite in the Amazon region. Various studies have examined the biochemical aspects of this venom, as well as local effects such as pain, edema, hemorrhage and myonecrosis that this species causes. In contrast, the systemic effects caused by this venom have been less studied. In this work, we investigated the hemodynamic alterations caused by B. atrox venom in anesthetized rats, as well as the possible mediators involved in this response. Methods: Male Wistar rats (300-400 g) anesthetized with isoflurane were cannulated for arterial blood pressure measurements (carotid artery) and for the intravenous (i.v., femoral vein) administration of test substances (venom, antagonists and inhibitors). In some experiments, venom was injected intramuscularly (i.m.). Respiratory rate was determined manually and ECG was monitored using conventional electrodes. At pre-established intervals, arterial blood was drawn for biochemical analyses and determination of venom kinetics. At the end of the experiments, tissue samples were collected from heart, liver, lung and muscle for histological analysis. The ability of commercial bothropic antivenom to neutralize selected venom enzymatic activities and the venom-induced hemodynamic alterations was assessed by preincubating venom with antivenom prior to testing for residual activity. Venom was also fractionated by gel filtration and the resulting peaks were screened for their activity on blood pressure. Results: Venom (0.4 mg/kg, i.v.) caused immediate hypotension (maximal at 5 min) followed by recovery over 20 min; there were no changes in heart rate, ECG or respiratory rate and no deaths (survival for up to 120 min post-venom). A higher dose of venom (0.7 mg/kg, i.v.) caused progressive hypotension, bradycardia and respiratory failure, with all rats (n=6) dying in 20±4 min. A similar hemodynamic profile to the lower dose of venom i.v. was seen with venom (4 mg/kg) given i.m. (gastrocnemius muscle). Venom given i.v. (lower dose) caused pulmonary thrombosis and hemorrhage, in addition to renal damage (epithelial desquamation, deposition of protein and microaneurysms); proteinuria and hemoglobinúria were observed in urine collected at the end of the experiment. Venom given i.m. or i.v. (higher dose) caused only pulmonary thrombosis. Renal damage (epithelial desquamation, proteinuria and hemoglobinuria) was seen with venom i.v. (0.4 mg/kg); venom given i.m. caused local hemorrhage and necrosis, and proteinuria. There were no histological alterations in the other tissues examined (heart, liver)... (AU)