ABSTRACT
ABSTRACT: The absolute quantification determines the absolute amount of a targeted nucleic acid expressed as a copy number or concentration. The knowledge of virus concentrations in commercial crops possesses high relevance to ensure a reliable diagnosis. The objective of this study was to perform an absolute quantification of five viruses in infected grapevines (Vitis spp.). Different known amounts of the standard sample (cloned viral cDNA or in vitro transcribed viral RNA) were quantified by TaqMan RT-qPCR. Based on these data, standard curves were generated plotting Ct values (threshold cycle) against the log of the standard sample amount. Infected grapevine samples were evaluated to determine virus titers, which were highly variable. This result may contribute to improve virus diagnosis by accurately quantifying virus titre variations in grapevines.
RESUMO: A quantificação absoluta determina a quantidade absoluta de um ácido nucleico alvo expressa como número de cópias ou concentração. O conhecimento das concentrações virais em culturas comerciais tem grande relevância para assegurar um diagnóstico confiável. O objetivo deste trabalho foi realizar uma quantificação absoluta de cinco vírus em videiras infectadas (Vitis spp.). Diferentes quantidades conhecidas da amostra padrão (cDNA viral clonado ou RNA viral transcrito in vitro) foram quantificadas por RT-qPCR TaqMan. A partir destes dados, curvas padrão foram geradas plotando-se os valores de Ct (ciclo limiar) contra o log da quantidade da amostra padrão. Amostras de videiras infectadas foram avaliadas visando-se determinar os títulos virais que foram bastante variáveis. Este resultado contribui para melhorar o diagnóstico viral ao quantificar com precisão variações no título viral em videiras.
ABSTRACT
A propagação vegetativa da videira favorece infecções virais múltiplas, com expressão diferencial de sintomas em função da combinação da cultivar ou espécie da hospedeira com a espécie viral. Os objetivos deste trabalho foram detectar e identificar as espécies virais presentes em duas espécies/cultivares de videira: uma sintomática e outra assintomática. DsRNA de ambas as amostras foi submetido à RT-PCR com 17 pares de oligonucleotídeos específicos para a detecção de Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 1 a 4 (GLRaV-1 a -4), além de três pares de oligonucleotídeos degenerados. Pelo menos um fragmento amplificado, por par de oligonucleotídeos, foi clonado e sequenciado. Plantas sintomáticas e assintomáticas mostraram infecções múltiplas por RSPaV, GLRaV-2 e/ou GLRaV-3. As sequências de nucleotídeos obtidas para sete isolados de RSPaV, três de GLRaV-2 e dois de GLRaV-3 apresentaram identidades superiores a 90 por cento com espécies homólogas e permitiram a definição das possíveis estirpes presentes nas amostras infectadas. Esses resultados evidenciam a necessidade da diagnose viral baseada em testes específicos para determinar a condição sanitária da videira.
The vegetative propagation of grapevine facilitates multiple viral infections, with different symptoms which vary according to combinations of cultivar or host species with viral species. The aims of this research were to detect and identify the viral species infecting two grapevine species/cultivars: one symptomatic and one symptomless. DsRNA from both samples was assayed by RT-PCR using 17 pairs of specific primers for detection of the Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine chrome mosaic virus (GCMV), Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) and Grapevine leafroll-associated virus 1-4 (GLRaV-1 to -4), besides three degenerate primer pairs. For each primer pair at least one amplicon was cloned and sequenced. Symtomatic and symptomless plants were multiple infected by RSPaV, GLRaV-2 and/or GLRaV-3. The nucleotide sequences of seven isolates of RSPaV, three of GLRaV-2 and two of GLRaV-3 showed identities higher than 90 percent with the homologous viral species and allowed to identify possible viral strains in infected samples. These results highlight the necessity of viral diagnosis based on specific assays to determine grapevine sanitary status.