Regulating the structure of bacterial cellulose by altering the expression of bcsD using CRISPR/dCas9 / 生物工程学报

Gluconacetobacter xylinus is a primary strain producing bacterial cellulose (BC). In G. xylinus, BcsD is a subunit of cellulose synthase and is participated in the assembly process of BC. A series of G. xylinus with different expression levels of the bcsD gene were obtained by using the CRISPR/dCas9 technique. Analysis of the structural characteristics of BC showed that the crystallinity and porosity of BC changed with the expression of bcsD. The porosity varied from 59.95%-84.05%, and the crystallinity varied from 74.26%-93.75%, while the yield of BC did not decrease significantly upon changing the expression levels of bcsD. The results showed that the porosity of bacterial cellulose significantly increased, while the crystallinity was positively correlated with the expression of bcsD, when the expression level of bcsD was below 55.34%. By altering the expression level of the bcsD gene, obtaining BC with different structures but stable yield through a one-step fermentation of G. xylinus was achieved.

Production of Cellulose and Profile Metabolites by Fermentation of Glycerol by Gluconacetobacter Xylinus

ABSTRACT Because of the widespread occurrence of cellulose in nature, many organisms use glycerol as a source of carbon and energy, so these organisms have drawn attention to the potential use of glycerol bioconversion. The bacteria Gluconacetobacter xylinus, a strictly aerobic strain that performing incomplete oxidation of various sugars and alcohols to cellulose biosynthesis. For this reason, we modify the Hestrim-Schram medium, associating glycerol, glucose and sucrose varying their concentration. The fermentations were performed statically at a temperature of 28˚C for a period of 10 days. The pH, membrane formation, crystallinity and the production of some metabolites of the 4th, 7th and 10th days was evaluated. The results showed a higher yield of membrane in the medium containing glucose, gly 1 + glu2 on 10 fermentation of 3.5 g %. Through solid-state NMR gave the crystallinity of the membranes, where there was a clear trend toward higher crystallinity membranes with 7 days of fermentation. Metabolic products found in the media by analysis of NMR spectroscopy in liquid were similar, especially for the production of alanine and lactate that were present in all media. The leucine and threonine were present in various media, although in small quantities has been found glutamate.

Desarrollo de cobertura y su evaluación en el tratamiento de las heridas crónicas / Desenvolvimento de cobertura e sua avaliação no tratamento de feridas crônicas / Development of coverage and its evaluation in the treatment of chronic wounds

Objective. To describe the development of the bacterial cellulose coating with anti-inflammatory Ibuprofen (BC/Ibu) and to evaluate the cicatrization process with its use in patients with chronic wounds of venous and diabetic etiology. Methods. Longitudinal descriptive study. The cellulose membrane, cultivated with bacteria Gluconacetobacter xylinus and with incorporation of Ibuprofen, was used in the treatment of patients with chronic wounds in public health services in a Brazilian municipality. The ideal coverage characteristics were evaluated through physical, chemical and cell proliferation tests. Results. The sample consisted of 14 patients (10 women and 4 men), 8 with venous ulcer, 5 with diabetic foot and one with mixed wound. There was reduction of area and pain in 9 lesions; total healing of 3 wounds; and debridement of the devitalized tissue in 5 wounds with increased area. The use of the membrane was important in the reduction of pain, exudation and ease in the accomplishment of the curative. Conclusion. BC/Ibu favored the cicatrization process of patients with chronic vasculogenic wounds.(AU)

Objetivo. Describir el desarrollo de la cobertura de celulosa bacteriana con antiinflamatorio Ibuprofeno (CB/Ibu) y evaluar el proceso de cicatrización en la utilización en pacientes con heridas crónicas de etiología venosa y diabética. Métodos. Estudio descriptivo longitudinal. La membrana de celulosa, cultivada con bacterias Gluconacetobacter xylinus y con incorporación del Ibuprofeno se utilizó en el tratamiento de pacientes con heridas crónicas en servicios de atención pública de un municipio brasileño. Se evaluaron características de cobertura ideal mediante pruebas físicas, químicas y de proliferación celular. Resultados. La muestra fue constituida por 14 pacientes (10 mujeres y 4 hombres): 8 con úlcera venosa, 5 con pie diabético y uno con herida mixta. Se redujo el área y el dolor en 9 lesiones; la cicatrización total de 3 heridas; y el debridamiento del tejido desvitalizado en 5 heridas con aumento del área. El uso de la membrana de celulosa disminuyó el dolor de la exudación y facilitó la realización del vendaje. Conclusión. La CB/Ibu favoreció el proceso de cicatrización de los pacientes con heridas crónicas vasculogénicas.(AU)

Objetivo. Descrever o desenvolvimento da cobertura de celulose bacteriana com anti-inflamatório Ibuprofeno (CB/Ibu) e avaliar o processo de cicatrização com a sua utilização em pacientes com feridas crônicas de etiologia venosa e diabética. Métodos. Estudo descritivo longitudinal. A membrana de celulose, cultivada com bactérias Gluconacetobacter xylinus e com incorporação do Ibuprofeno, foi utilizada no tratamento de pacientes com feridas crônicas em serviços de atendimento público de um município brasileiro. Foram avaliadas as características de cobertura ideal mediante testes físicos, químicos e de proliferação celular. Resultados. A amostra foi constituída por 14 pacientes (10 mulheres e 4 homens), sendo 8 com úlcera venosa, 5 com pé diabético e um com ferida mista. Houve redução da área e da dor em 9 lesões; cicatrização total de 3 feridas; e o debridamento do tecido desvitalizado em 5 feridas com aumento da área. O uso da membrana além da diminuição da dor, da exsudação e facilidade na realização do curativo. Conclusão. A CB/Ibu favoreceu o processo cicatrização dos pacientes com feridas crônicas vasculogênicas. (AU)

Bacterial cellulose and bacterial cellulose/polycaprolactone composite as tissue substitutes in rabbits' cornea / Celulose bacteriana e composto de celulose bacteriana/policaprolactone para substituto tissular na córnea de coelho

In order to test the performance of bacterial cellulose/polycaprolactone composite (BC/PCL) and pure bacterial cellulose (BC) as tissue substitutes in rabbits' cornea, a superficial ulcer containing 5mm in diameter and 0.2mm deep was made in the right cornea of 36 rabbits, then a interlayer pocket was created from the basis of this ulcer. Twelve rabbits received BC/PCL membrane and 12 were treated with BC membranes, both membranes with 8mm in diameter. The remaining rabbits received no membrane constituting the control group. The animals were clinically followed up for 45 days. Three animals of each group were euthanized at three, seven, 21, and 45 days after implantation for histological examination of the cornea along with the implant. Clinical observation revealed signs of moderate inflammatory process, decreasing from day 20th in the implanted groups. Histology showed absence of epithelium on the membranes, fibroplasia close to the implants, lymph inflammatory infiltrate with giant cells, collagen disorganization, with a predominance of immature collagen fibers in both groups with implants. Although inflammatory response is acceptable, the membranes used does not satisfactorily played the role of tissue substitute for the cornea during the study period.(AU)

Com objetivo de testar o desempenho do compósito celulose bacteriana/policaprolactona (CB/PCL) e da celulose bacteriana pura (CB) como substitutos teciduais em córnea de coelhos, foi realizada uma úlcera superficial de 5 mm de diâmetro e 0,2 mm de profundidade na córnea direita de 36 coelhos, criando-se um bolso interlamelar a partir da base dessa úlcera. Doze animais receberam a membrana do compósito CB/PCL e 12 foram tratados com membranas de CB, ambas com 8 mm de diâmetro, os coelhos restantes não receberam nenhuma membrana, constituindo o grupo controle. Os animais foram acompanhados clinicamente até 45 dias. Três animais de cada grupo sofreram eutanásia aos três, sete, 21 e 45 dias após o implante das membranas para análise histológica da córnea juntamente com o implante. À observação clínica, houve sinais de processo inflamatório moderado, diminuindo a partir do 20º dia nos grupos implantados. A histologia demonstrou ausência de epitélio sobre as membranas, fibroplasia próxima aos implantes, infiltrado inflamatório linfo-histiocitário com células gigantes, desorganização do colágeno, com predominância de fibras imaturas de colágeno em ambos os grupos com implantes. Embora a resposta inflamatória seja aceitável, as membranas utilizadas não desempenharam satisfatoriamente o papel de substituto tecidual para a córnea, no período estudado.(AU)

Efecto de la melaza de caña tratada con ácido sulfúrico en la producción de celulosa por Gluconacetobacter xylinus IFO 13693 / Effect of molasses cane treated with sulfuric acid in the production of cellulose by Gluconacetobacter xylinus IFO 13693 / Efeito do melaço de cana tratada com ácido sulfúrico na produção de celulose por Gluconacetobacter xylinus IFO 13693

En este estudio se evaluó el efecto de la melaza tratada con ácido sulfúrico (MZA-TR) y de las condiciones del cultivo (estático) sobre la síntesis de celulosa por Gluconacetobacter xylinus IFO 13693, para ello, se usó un reactor con 0,2 litros de medio de cultivo, con concentraciones iniciales de 13,3 % y 26,6 % de MZA-TR en el medio de cultivo a pH 5,6. El volumen del inóculo fue del 10 % del volumen total del medio; el proceso se realizó a temperatura ambiente (30 °C), con tiempos de incubación de 3, 7, 14, 21 y 28 días. Además, se evaluaron distintos parámetros fisicoquímicos y mecánicos de la celulosa. El grosor de la película de celulosa presentó un máximo de 2,5 cm, siendo el mejor resultado obtenido, en comparación con anteriores reportes en la literatura. También se encontró que al usar MZA-TR en el medio de cultivo hay un incremento considerable de la producción de celulosa en estático a los 28 días de incubación. Finalmente, se observó que el consumo de glucosa y de fructosa disminuye durante la síntesis de celulosa bacteriana (CB); durante los 3 primeros días de incubación se observó el máximo descenso, lo que permite correlacionar la producción de CB con el consumo de medio. La concentración de 13,3 %, presenta los mejores resultados en los parámetros de velocidad de crecimiento microbiano, cantidad y calidad de la celulosa producida.

This study assessed the effect of molasses treated with sulfuric acid (MZA-TR) and the condition of the crop (static) on the synthesis of cellulose by Gluconacetobacter xylinus IFO 13693, using a reactor with 0,2 liters of growing medium, with initial concentrations of 13,3 % and 26,6 % of molasses treated (MZA-TR) in the culture medium at pH 5,6. The volume of the inoculum was 10 per cent of the total volume of the environment; the process was carried out at ambient temperature (30 °C), with times of incubation of 3, 7, 14, 21 and 28 days. Also, different physico-chemical and mechanical parameters of the pulp were evaluated. The thickness of the cellulose film presented a maximum of 2.5 cm, being the best result obtained, in comparison to previous reports in the literature. Furthermore, it was found that using MZA-TR in the middle considerably increased the production of cellulose in static at 28 days of incubation. Finally, it was observed that the consumption of glucose and fructose decreased during the synthesis of Bacterial Cellulose (BC); during the first 3 days of incubation it was noted the maximum decline, which allows to correlate the production of CB with the consumption of media. The concentration of 13.3 %, presents the best results in the speed parameters of microbial growth, the quantity and quality of cellulose produced.

Neste estudo foi avaliado o efeito do melaço tratado com ácido sulfúrico (MZA-TR) e das condições da cultura (estática) sobre a síntese de celulose pelo Gluconacetobacter xylinus IFO 13693. Para isso, foi utilizado um reator com 0,2 litros de meio de cultura, com concentrações iniciais de 13,3 e 26,6% de MZA-TR, e pH igual a 5,6. O volume de inoculo foi de 10% do volume total do meio, e o processo foi realizado a temperatura ambiente (30°C), com tempos de 3, 7, 14, 21 e 28 dias. Além disso, foram avaliados os distintos parâmetros físico-químicos e mecânicos da celulose. A espessura máxima que apresentou o filme de celulose foi de 2,5 cm, sendo o melhor resultado obtido, ao comparar com os reportados anteriormente na literatura. Verificou-se também que ao usar MZA-TR no meio de cultura houve um aumento considerável na produção de celulose no meio estático aos 28 dias de incubação. Finalmente foi observado que o consumo de glicose e frutose diminuiu durante a síntese de celulose bacteriana (CB). Durante os três primeiros dias de incubação verificou-se a diminuição máxima, o que permite correlacionar a produção de CB com o consumo do meio. A concentração de 13,3% apresentou os melhores resultados nos parâmetros da velocidade de crescimento microbiano, quantidade e qualidade da celulose produzida.

Produção de biofilme (membrana de biocelulose) por Gluconacetobacter xylinus em meio de resíduos de frutas e folhas de chá verde / Biofilm production (biocellulose membrane), production by Gluconacetobacter xylinus in fruits residues and green tea medium

A biomembrana, que é uma membrana de celulose bacteriana (C6H10O5)n formada na superfície do meio de cultivo durante a fermentação acética, foi obtida através do cultivo associado de Gluconacetobacter xylinus (formalmente Acetobacter xylinum) e Saccharomyces cerevisiae em meio de folhas de chá verde, resíduos de frutas (abacaxi, mamão, laranja), resíduos de vegetais (beterraba), vinho e colágeno em condições estáticas a 28 ± 2°C de 7 a 30 dias de cultivo. Foi incorporado à biomembrana, extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis, devido as suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e cicatrizantes. A espessura, o diâmetro e o peso da biomembrana foram mensurados e foram calculados a produtividade, bem como o fator de conversão de açúcar em celulose. A caracterização da biomembrana foi realizada por Differential Scanning Calorimetric, espectroscopia infravermelho, Brunauer-Emmett-Teller, resistência à tração e alongamento, microscopia eletrônica (Escola Politécnica - USP) e difração de raio-X. Através destas análises verificou-se que a biomembrana obtida nos diferentes meios de cultivo é composta por celulose, o tamanho médio dos poros variou de 517,9 a 1582,0 nm, a resistência à tração variou de 0,76 a 4,32 kN/m e o índice de cristalinidade entre 75% e 91%, a espessura da biomembranas variou de 0,16 a 6,38 mm. Foram realizados 576 experimentos, a maior produtividade (8,23 g de celulose/dia) foi atingida no meio de mamão com suco de laranja (suco de mamão: 50% v/v e suco de laranja: 19% v/v) em 7 dias de cultivo. O maior fator de conversão (2,36 g celulose/g de açúcar) foi obtido no meio de chá verde em 25 dias de cultivo. A adição de 1,5% p/v de colágeno ao meio de chá verde dobrou a massa da biomembrana. A incorporação do extrato de calêndula aumentou a flexibilidade, a cristalinidade e as propriedades mecânicas da biomembrana de chá verde

The biomembrane, cellulose membrane (C6H10O5)n formed in medium surface, was obtained from an associate culture Gluconacetobacter xylinus (formally Acetobacter xylinum) and Saccharomyces cerevisiae in green tea leaves, fruit residues (pineapple, papaya, orange), vegetables residues (beet), wine and collagen media in static condition , at 28 ± 2 ºC in 7 - 30 days cultivation. The Calendula officinalis hydroalcoholic extract was incorporated in the Biomembrane, due to its anti-inflammatory, anti-oxidants and cicatrizing proprieties. The biomembrane thickness, diameter and weight were measured. The productivity and conversion factor from cellulose to sugar were calculated. The biomembrane caracterization was performed by Differential Scanning Calorimetric, infrared spectroscopy, Brunauer-Emmett-Teller, resistance to tension, elongation, eletrocnic microscopy and raio-X difraction. In these analyses were verified that biomembrane obtained in different media were composed by cellulose, average porous size varied from 517.9 to 1582.0 nm, the resistance to tension varied from 0.76 to 4.32 kN/m and cristalinity index varied from 75% to 91%. The biomembrane thickness varied from 0,16 to 6,38 mm. It was performed 596 tests, the highest bacterial cellulose yield (8.23 ± 0.58 g cellulose/day) was obtained in papaya with orange (papaya juice: 50% v/v and orange juice: 19% v/v) in 7 cultivation days. The highest conversion factor (2,36 g cellulose/g sugar) was obtained in green tea medium in 25 days. The addition of 1.5% w/v collagen to the green tea media increased 2 times the biomembrane weight. The biomembrane absorption capacity for water and Marigold hydroalcoholic extract (1:1), were from 1.73 to 22 and, from 1.75 to 24 times dry weight, respectively. The Marigold extract improved the green tea biomembrane flexibility, cristalinity, and physical proprieties

Efecto de la sacarosa en la producción de celulosa por Gluconacetobacter xylinus en cultivo estático / Effect of sucrose in the production of cellulose by Gluconacetobacter xylinus in static culture

Objetivo. Determinar el efecto de sacarosa en la productividad de BC por Gluconacetobacter xylinus IFO 13693 en condición estática. Materiales y métodos. La síntesis de celulosa bacteriana (BC) por Gluconacetobacter xylinus se llevo a cabo en un cultivo estático discontinuo a temperatura ambiente, en presencia de sacarosa como la principal fuente de carbono a concentraciones iniciales de 0.8 a 7.6 % (p/v). Las concentraciones remanentes de BC, sacarosa, glucosa y fructosa se determinaron cada semana. Para la cinética de la hidrólisis de la sacarosa y formación de celulosa y el coeficiente de rendimiento del producto se utilizo el software Microcal Origin 6.0®. Resultados. En la cuarta semana los valores de BC se encontraron entre 32.5 a 39.5 g/L para las diferentes concentraciones de sacarosa. La cinética para la hidrólisis de sacarosa se ajusta al modelo de Michaelis-Menten, con una Vmax de 0.0002 mol L-1 h-1 y Km de 0.018 M. La producción de BC se ajusta al modelo propuesto por Marx-Figini y Pion, con un valor de la pendiente (kc), entre 0.0018 y 0.0024 h-1 para las diferentes concentraciones iniciales de sacarosa. Los coeficientes de rendimiento tienen valores de 0.8 a 2.4 g de BC producida/g de sacarosa consumida. Conclusiones. La hidrólisis de sacarosa, el consumo de glucosa y fructosa se refleja en la síntesis de celulosa. La hidrólisis de sacarosa y la producción de BC se ajustan a los modelos de Michaelis-Menten y al propuesto por Marx-Figini y Pion, respectivamente. Finalmente, el rendimiento depende de la concentración de sacarosa.

Objective. Determine the effect of sucrose on the productivity of BC by Gluconacetobacter xylinus IFO 13693 in static condition. Materials and methods. The synthesis of bacterial cellulose (BC) by Gluconacetobacter xylinus was carried out in a discontinuous static culture at room temperature, in the presence of sucrose as the main carbon source at initial concentrations of 0.8 to 7.6% (p/v). The residual concentrations of BC, sucrose, glucose and fructose were measured every week. The Microcal Origin 6.0®. Software used to determine the kinetics of hydrolysis of sucrose and formation of cellulose and the coefficient of performance of the product Results. In the fourth week the BC values were between 32.5 to 39.5 g/L for the different concentrations of sucrose. The kinetics for the hydrolysis of sucrose fits the Michaelis-Menten model, with a Vmax of 0.0002 mol L-1 h-1 and Km of 0.018 M. The production of BC follows the model proposed by Marx-Figini and Pion, with a value of the slope (kc) between 0.0018 and 0.0024 h-1 for different initial concentrations of sucrose. The yield coefficients have values of 0.8 to 2.4 g of BC produced / g of sucrose consumed. Conclusions. The hydrolysis of sucrose, fructose consumption and glucose is reflected in cellulose synthesis. The hydrolysis of sucrose and production of BC fit the Michaelis-Menten model and the model proposed by Marx-Figini and Pion, respectively. Finally, the performance depends on the concentration of sucrose.