Genetic characterization of the haemagglutinin gene in canine distemper virus strains from naturally infected dogs in Brazil / Caracterização genética do gene da hemaglutinina em vírus da cinomose canina de cães naturalmente infectados no Brasil

Canine distemper is one of the major infectious diseases in dogs and wild animals, resulting in high morbidity and mortality. The H gene has the greatest genetic variability among the genes encoded by the canine distemper virus (CDV) genome, and it has been used to characterise field samples, allowing the identification of specific lineages. Variation in the H gene can allow the virus to evade recognition by vaccine-induced antibodies, resulting in vaccine failure. The purpose of this study was to characterise H gene in CDV strains from naturally infected dogs in the state of São Paulo. The phylogenetic analysis revealed that Brazilian CDV strains were genetically related to the circulating CDV strains in Uruguay, Argentina, and Europe. We found no evidence of South America 2 and 3 CDV lineages circulating in Brazilian dogs. The degree of genetic divergence between wild Brazilian CDV strains and vaccine strains may suggest the possibility of vaccine failures and consequently the occurrence of canine distemper outbreaks.(AU)

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas em cães e animais selvagens, resultando em alta morbidade e mortalidade. O gene H tem uma das maiores variabilidades genéticas entre os genes codificados pelo vírus da cinomose canina (CDV), e tem sido utilizado para caracterizar as estirpes de CDV, permitindo a identificação de linhagens específicas. A variação no gene H pode permitir que o vírus evite o reconhecimento por anticorpos induzidos pela vacina, resultando em falha vacinal. O objetivo deste estudo foi caracterizar o gene H em estirpes de CDV de cães infectados naturalmente no estado de São Paulo. A análise filogenética revelou que as estirpes de CDV brasileiras estão geneticamente relacionadas as estirpes circulantes no Uruguai, na Argentina e na Europa. Não foi encontrada nenhuma evidência da circulação no estado de São Paulo das linhagens América do Sul 2 e 3. O grau de divergência genética entre linhagens selvagens de CDV brasileiras e as estirpes vacinais podem sugerir a possibilidade de falhas vacinais e consequentemente a ocorrência de surtos de cinomose canina.(AU)

Expression of the hemagglutinin HA1 subunit of the equine influenza virus using a baculovirus expression system / Expresión de la subunidad HA1 del virus de influenza equina utilizando un sistema de expresión en baculovirus

Equine influenza virus is a leading cause of respiratory disease in horses worldwide. Disease prevention is by vaccination with inactivated whole virus vaccines. Most current influenza vaccines are generated in embryonated hens' eggs. Virions are harvested from allantoic fluid and chemically inactivated. Although this system has served well over the years, the use of eggs as the substrate for vaccine production has several well-recognized disadvantages (cost, egg supply, waste disposal and yield in eggs). The aim of this study was to evaluate a baculovirus system as a potential method for producing recombinant equine influenza hemagglutinin to be used as a vaccine. The hemagglutinin ectodomain (HA1 subunit) was cloned and expressed using a baculovirus expression vector. The expression was determined by SDS-PAGE and immunoblotting. A high yield, 20 μg/ml of viral protein, was obtained from recombinant baculovirus-infected cells. The immune response in BALB/c mice was examined following rHA1 inoculation. Preliminary results show that recombinant hemagglutinin expressed from baculovirus elicits a strong antibody response in mice; therefore it could be used as an antigen for subunit vaccines and diagnostic tests.

El virus de la influenza equina es una de las principales causas de enfermedad respiratoria en caballos de todo el mundo. La prevención de la enfermedad es a través de la vacunación con vacunas a virus inactivado. La mayoría de las vacunas se producen en huevos embrionados, de los cuales los viriones son cosechados del líquido alantoideo e inactivados químicamente. Aunque este sistema ha servido bien durante años, el uso de huevos como sustrato para la producción de vacuna presenta varias desventajas bien reconocidas (costo, provisión de huevos, manejo de los residuos, rinde por huevo). El objetivo del presente trabajo fue evaluar preliminarmente un sistema de expresión en baculovirus como método de producción de hemoaglutinina recombinante (rHA) para ser utilizada como vacuna para la prevención de la influenza equina. Para ello el ectodominio de la hemaglutinina (la subunidad HA1) del virus de la influenza equina se expresó en células de insecto infectadas con un baculovirus recombinante. La expresión fue demostrada por SDS-PAGE e inmunoblotting. El método empleado fue capaz de producir gran cantidad de rHA1. En este estudio se obtuvieron 20 μg/ml (200 μg de HA1 purificada de 2,5x107 células infectadas). La respuesta inmune fue evaluada mediante la inmunización de ratones BALB/c. Los resultados preliminares demostraron que la proteína recombinante expresada en baculovirus genera una fuerte respuesta inmune en ratones, por lo tanto podría ser utilizada como antígeno para la producción de una vacuna a subunidades y en pruebas diagnósticas.

Detecção molecular e análise filogenética do gene H de amostras do vírus da cinomose canina em circulação no município de Campinas, São Paulo / Molecular detection and phylogenetic analysis of the gene H from canine distemper virus isolates circulating at the municipality of Campinas, São Paulo

O vírus da cinomose canina (CDV), um Morbillivirus da família Paramyxoviridae, é o agente etiológico de doença neurológica e sistêmica em cães. O diagnóstico laboratorial da infecção requer o isolamento viral ou detecção do material genético do vírus em secreções ou tecidos de cães com suspeita clínica da doença. A diversidade genética entre os isolados de CDV pode ser aferida pelo sequenciamento efilogenia molecular do gene que codifica a hemaglutinina viral (gene H), havendo atualmente um especial interesse em comparar as amostras circulantes a campo com o genogrupo América-1, que abrange as cepas presentes nas vacinas disponíveis no mercado. No presente estudo, foi realizada a detecção molecular do gene H de CDV a partir de amostras biológicas colhidas ante- e post- -mortem de 15 cães com sinais clínicos sugestivos de cinomose na região metropolitana de Campinas, São Paulo. Dez dos 15 cães analisados tiveram ao menos um órgão positivo na detecção molecular e os amplicons obtidos foram submetidos ao sequenciamento nucleotídico seguido de análise filogenética molecular. De forma semelhante ao que já foi reportado para estudo analisando a diversidade do gene H em outros países, a reconstrução filogenética obtida para as amostras de casos de cinomose da região de Campinas demonstrou as mesmas foram agrupadas junto a amostras norte-americanas, europeias e japonesas recentes, em um grupo genético distinto do grupo de amostras clássicas de CDV, nomeado America-1, o qual engloba as estirpes vacinais Snyder Hill, Onderstepoort e Lederle.

Canine distemper virus (CDV), a Morbillivirus of the family Paramyxoviridae, is the etiological agent of neurological and systemic disease in dogs. The laboratory diagnosis of infection requires viral isolation or detection of genetic material of the virus in secretions or tissues of dogs with clinical suspicion of the disease. The genetic diversity among isolates of CDV can be assessed by sequencing and phylogenetic analysis of the gene that encodes the viral hemagglutinin (H gene), and there is currently a special interest in comparing the strains currently circulating in the field with the genogroup America-1, which comprises strains present in vaccines available in the market. In this study, the molecular detection of CDV gene H was performed from biological samples harvested ante-and post-mortem from 15 dogs with clinical signs suggestive of canine distemper in the metropolitan region of Campinas, São Paulo. Ten of the 15 dogs examined had at least one positive organ under molecular detection and the obtained amplicons were sequenced and further analyzed by molecular phylogenetic analysis. Similarly to what has already been reported on previous studies regarding the diversity of the gene H in other countries, the phylogenetic reconstruction obtained for the samples of cases of distemper from Campinas region showed they were grouped with the North American, European and Japanese newly described samples, a genetic group distinguished from classical samples of CDV, named America-1, which encompasses the vaccine strains Snyder Hill, Onderstepoort and Lederle.

Caracterização genética dos vírus do sarampo genótipo D4 detectados no Brasil no período de 2003-2012 / Genetic characterisation of measles virus genotype D4 detected in Brazil, 2003-2012

O sarampo é uma doença exantemática viral, altamente infecciosa, causada por um vírus da família Paramyxoviridae, gênero Morbillivirus que, apesar de estar disponível uma vacina, segura e eficaz contra a doença, esta ainda constitui uma importante causa de morbidade e mortalidade infantil em muitos países em desenvolvimento. Embora exista apenas um tipo antigênico do vírus do sarampo, estudos de caracterização genética dos vírus de tipo selvagem permitiram a identificação oito subtipos (A-H) e 24 genótipos. O Brasil eliminou a transmissão autóctone do vírus do sarampo a partir do ano 2000. A partir de então foram confirmados vários casos de sarampo importados ou relacionados a importações, principalmente do genótipo D4. A epidemiologia molecular dos vírus do sarampo baseada nas análises da região C-terminal da nucleoproteína tem demonstrado uma diversidade limitada entre as cepas circulantes, dificultando dessa forma a determinação da origem dos vírus usando apenas essa região. O objetivo deste trabalho foi caracterizar geneticamente os genótipos D4 dos vírus do sarampo detectados no Brasil no período de 2003 a 2012, e para tal, as sequências da proteína H completa e do gene N parcial foram analisadas. Os casos positivos para o genótipo D4 foram previamente identificados pela amplificação dos 450nt da região C-terminal da proteína N por RT-PCR, as sequências completas do gene H destas amostras foram diretamente amplificadas por RT-PCR a partir das amostras clínicas e posteriormente sequenciado.As análises filogenéticas da sequência de nucleotídeos do gene N e do gene H completomos traram que os vírus do sarampo genótipo D4 detectados no Brasil podem ser resultado de várias importações de diferentes variantes do mesmo genótipo que circulam na Europa. Foram identificadas mutações nas sequências de aminoácidos tantodo gene N parcial como do gene H completo dos genótipos D4 dos vírus do sarampo detectados no Brasil...

Measles is a highly infectious viral exanthem of the family Paramyxoviridae, genusMorbillivirus. Despite the availability of a safe and effective vaccine, measles infectioncontinues to be an important cause of infantile morbidity and mortality in developingcountries. Although there is only one antigenic type of the measles virus, geneticcharacterisation of the wild-type virus identified 8 subtypes (A-H), with a total of 24genotypes being recognised. From 2000, the indigenous transmission of the measlesvirus has been eliminated in Brazil. Since then, several cases of imported measles, orcases associated with importations, were confirmed, principally of genotype D4. Themolecular epidemiology of the measles virus based on analyses of the C-terminal regionof the nucleoprotein has demonstrated a limited diversity between circulating strains,making it difficult to determine the origin of the virus by this genomic region alone. Theobjective of this study was to genetically characterise the D4 genotype of measlesviruses detected in Brazil from 2003 to 2012 by analysing sequences from the completeH gene and partial N gene of the virus. Cases positive for measles genotype D4 werepreviously identified by the amplification of a 450nt of the C-terminal region of the Nprotein by RT-PCR. The complete H gene from these samples was amplified by RTPCRdirectly from clinical samples and subsequently sequenced. Phylogenetic analysisof the nucleotide sequences of the N gene and the complete H gene demonstrated thatthe measles D4 genotype detected in Brazil may have been a result of severalimportations of different variants of the same genotype circulating in Europe...

Isolation and characterization of a pandemic H1N1 influenza virus in pigs in Brazil / Isolamento e caracterização do vírus da influenza pandêmico H1N1 em suínos no Brasil

Influenza A virus (IAV) infections are endemic in pork producing countries around the world. The emergence of the pandemic 2009 human H1N1 influenza A virus (pH1N1) raised questions about the occurrence of this virus in Brazilian swine population. During a 2009-2010 swine influenza virus research project at Embrapa Swine and Poultry (CNPSA), an outbreak of a highly transmissible H1N1 influenza A virus disease was detected in a pig herd in Santa Catarina State, Brazil. The virus caused a mild disease in growing pigs and sows without mortality. Three clinically affected piglets were euthanized. Gross lesions included mild to moderate consolidation of cranioventral areas of the lung. Microscopically, the lesions were characterized by necrotizing obliterative bronchiolitis and bronchointerstitial pneumonia. Immunohistochemistry using a monoclonal antibody against type A influenza virus nucleoprotein revealed positive staining in the nuclei of the bronchiolar epithelial cells. Lung tissue from three piglets and nasal swabs from five sows and four piglets were positive for influenza A by RT-PCR. Influenza virus was isolated from one lung, later confirmed by the hemagglutination test (HA titer 1:128) and RT-PCR. Sequence analyses of Hemmaglutinin (HA) and Matrix (M) genes revealed that the virus was consistent with the pandemic (A/H1N1) 2009 influenza virus strain that circulated in humans. This is the first report of an outbreak of pandemic A/H1N1 influenza virus in pigs in Brazil.

A infecção causada pelo vírus Influenza A (IAV) é endêmica em suínos no mundo inteiro. O surgimento da pandemia de influenza humana pelo vírus A/H1N1 (pH1N1) em 2009 levantou dúvidas sobre a ocorrência deste vírus em suínos no Brasil. Durante o desenvolvimento de um projeto de pesquisa do vírus de influenza suína em 2009-2010, na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA), foi detectado em um rebanho de suínos em Santa Catarina, Brasil, um surto de influenza altamente transmissível causado pelo subtipo viral H1N1. Este vírus causou uma doença leve em suínos em crescimento e em fêmeas adultas, sem mortalidade. Tres leitões clinicamente afetados foram eutanasiados. As lesões macroscópicas incluiam consolidação leve a moderada das áreas cranioventrais do pulmão. Microscopicamente, as lesões foram caracterizadas por bronquiolite necrosante obliterativa e pneumonia broncointersticial. A imunohistoquímica, utilizando um anticorpo monoclonal contra a nucleoproteína do vírus influenza A, revelou marcação positiva no núcleo das células epiteliais bronquiolares. O tecido pulmonar de três leitões e os suabes nasais de cinco fêmeas e quatro leitões foram positivos para influenza A pela RT-PCR. O vírus influenza foi isolado de um pulmão, mais tarde sendo confirmado pelo teste de hemaglutinação (título HA 1:128) e por RT-PCR. A análise das seqüências de nucleotídeos dos genes da hemaglutinina (HA) e proteína da matriz (M) revelou que o vírus isolado foi consistente com o vírus pandêmico A/H1N1/2009 que circulou em humanos no mesmo período. Este é o primeiro relato de um surto de influenza causado pelo vírus pandêmico A/H1N1 em suínos no Brasil.

Detección del virus influenza pandémica A (H1N1) en Paraguay 2009, y amplificación de genes hemaglutinina y neuraminidasa / Detection of pandemic influenza A (H1N1) virus in Paraguay in 2009, and amplification of the hemagglutinin and neuraminidase genes

Introducción: El virus de influenza pandémica A (H1N1), cuya circulación se inició en abril del año 2009 en México y Estados Unidos, se constituyó en el último virus pandémico desde los casos detectados en Hong Kong en 1968. El genoma del virus de influenza A está formado por 8 segmentos ARN de cadena simple (polaridad negativa), que codifican para 10 proteínas. Los genes hemaglutinina y neuraminidasa codifican para dos proteínas de superficie y son los utilizados en los análisis de variabilidad genética. Objetivos: a) Detectar la circulación del virus pandémico en pacientes con sospecha clínica de infección por influenza, y b) Diseñar una estrategia para amplificar de forma completa los genes hemaglutinina y neuraminidasa. Materiales y Métodos: Fueron analizados por Real-Time RT-PCR (transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real) un total de 181 muestras de hisopado faríngeo, colectadas o remitidas al Hospital de Clínicas, del 6 de agosto al 11 de octubre de 2009. Para el diseño de amplificación de los genes hemaglutinina y neuraminidasa, se han utilizado herramientas bioinformáticas y reacción en cadena de la polimerasa. Resultados: Del total de muestras analizadas, 27 (14.9 %) dieron resultado positivo para el nuevo virus pandémico. Por otra parte, la amplificación completa de ambos genes proporcionó los resultados esperados: 1678-pares de bases (pb) para la hemaglutinina, y 1427-pb para la neuraminidasa. Conclusiones: La implementación de esta tecnología de amplificación permitirá posteriormente la secuenciación de estos genes a fin de determinar las variaciones genéticas del virus que podrían tener un impacto en la salud humana.

Introduction: The pandemic influenza A (H1N1) virus, whose circulation was detected in April 2009 in Mexico and the United States, is the latest pandemic virus since the cases reported in Hong Kong in 1968. The genome of the influenza A virus consists of 8 segments of single-stranded RNA of negative polarity, coding for 10 proteins. The hemagglutinin and neuraminidase genes encode for two surface proteins and are used in the analysis of genetic variability. Objectives: a) to detect circulation of the pandemic virus in patients with clinical suspicion of influenza infection and b) design a strategy to fully amplify the hemagglutinin and neuraminidase genes.Materials and Methods: A total of 181 pharyngeal swabs were collected and sent to the Hospital de Clínicas for analysis using Real-Time RT-PCR (reverse transcription and polymerase chain reaction in real time) between 6 August and 11 October 2009. To design the amplification of hemagglutinin and neuraminidase genes, we used bioinformatic tools and polimerase chain reaction. Results: Of the samples analyzed, 27 (14.9%) were positive for the new pandemic virus. Moreover, the complete amplification of both genes provided the expected results: 1678-base pairs (bp) for the hemagglutinin, and 1427-bp for neuraminidase. Conclusions: The use of this technology for amplification will eventually allow sequencing to identify genetic variations of the virus that could have an impact on human health.

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.

Surveillance of adamantane resistance among influenza A H3 viruses isolated in Argentina between 2001 and 2007 / Vigilancia de la resistencia a los adamantanos entre los virus influenza A H3 aislados en Argentina entre 2001 y 2007

A dramatic rise in the frequency of resistance to adamantane drugs by influenza A H3 viruses, associated with a single amino acid replacement in the viral matrix M2 protein, has occurred in multiple countries worldwide in recent years. We investigated the frequency of adamantane-resistant influenza A H3 viruses in Argentina during the period 2001- 2007. We used reverse transcription followed by polymerase chain reaction. The obtained products were sequenced for the detection of mutations of the M2 gene relevant to the resistance phenotypes. The HA1 sequences of the sensitive and resistant strains were also analyzed to clarify whether they had any relevance to the resistant mutations. Twenty out of 55 (36%) strains were identified with the resistance-conferring substitution at amino acid 31 (Serine 31 Asparagine). No resistant viruses were detected between 2001 and 2005. All strains isolated in 2006 and four out of five isolates from 2007 were resistant. None of the patients had received previous treatment with amantadine and/or rimantadine. The HA1 analysis showed that there were only two changes (Serine193 Phenylalanine and Aspartic acid 225 Asparagine) present in the strains with the M2 substitution at position 31. Our data indicate that since 2006 there has been a significant increase of adamantane-resistant influenza A H3 viruses, which raises concern over the spread of these viruses in Argentina.

En los últimos años, se ha detectado un aumento de virus influenza A H3 resistentes a los adamantanos en distintos países, asociados mayoritariamente con el reemplazo de un único aminoácido de la proteína matriz M2. Se investigó la frecuencia de virus influenza A H3 resistentes a los adamantanos en Argentina entre 2001 y 2007. Se utilizó la transcripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa y de la técnica de secuencia directa para la detección de mutaciones en el gen que codifica para la proteína M2, relevantes para los fenotipos de resistencia. También se analizó la secuencia de la porción HA1 de cepas resistentes y sensibles, para intentar establecer alguna relación con las mutaciones de M2. De un total de 55 cepas, 20 (36%) fueron resistentes debido a un cambio aminoacídico en la posición 31 (serina 31 asparagina). No se detectaron cepas resistentes entre 2001 y 2005. Las cepas aisladas en el 2006 y 4 de 5 cepas obtenidas en el 2007 fueron resistentes. Ninguno de los pacientes de los que se habían aislado esas cepas había recibido tratamiento antiviral con anterioridad. En la porción secuenciada de HA1 se encontraron dos cambios (serina 193 fenilalanina y ácido aspártico 225 asparagina), presentes sólo en las cepas que tuvieron la mutación en la posición 31 de M2. Desde el año 2006 se ha registrado en Argentina un aumento significativo de la circulación de virus influenza A H3 con genotipo resistente, lo que genera expectativa con respecto a su diseminación en nuestro país.

Caracterización biológica de tres aislamientos naturales del Rubulavirus porcino (México)

Biological characterization of three natural isolates of the porcine rubulavirus (Mexico). Porcine rubulavirus (PoRV) produces a neurological and reproductive syndrome in pigs called the blue-eye disease, known only from Mexico. Several isolates were grouped by the main symptoms presented during outbreaks: a) neurotropic in piglets, b) broadly neurotropic in piglets and gonadotropic in adults, and c) gonadotropic in adults. We studied some biological properties of three strains, which fall in one of each virus group: La Piedad Michoacán (LPM) and Producción Animal Cerdos 1 (PAC1) and 3 (PAC3), respectively. The analyzed viral properties are mainly related with the trans-membrane hemagglutinin-neuraminidase (HN) and fusion (F) proteins, such as cytopathic effect, hemolysis, hemagglutinating (HA) and neuraminidase (NA) activities. In the infection assays PAC1 strain presented the highest fusogenicity level; however, the most cytolytic strain was PAC3. In addition, HA and NA activities and viral genome of PAC3 strain was detected in supernatants during cell infection earlier than in the other two strains, which shows that PAC3 virions release from the host cell earlier than LPM and PAC1. Experimental determination in purified viruses shows that PAC3 presented a higher HA and NA activities; however, PAC1 shows other interesting properties, such as a high thermostability of HN and differences about substrate profile respect to LPM and PAC3. Our data suggest that NA activity is associated with the virulence of RVP. Rev. Biol. Trop. 56 (2): 487-499. Epub 2008 June 30.

El Rubulavirus porcino causa un síndrome neurológico y reproductivo en cerdos, hasta ahora reportado sólo en México. Los virus aislados se agrupan de acuerdo con los síntomas principales observados durante los brotes en: a) neutrópicos en lechones, b) neurotrópicos en lechones/gonadotrópicos en adultos y c) gonadotrópicos en adultos. En este trabajo se estudiaron tres cepas: La Piedad Michoacán (LPM) y Producción Animal "Cerdos" 1 (PAC1) y 3 (PAC3), ubicadas respectivamente en cada grupo. Las propiedades estudiadas se relacionan principalmente con dos proteínas de la envoltura viral, la hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F). Se cuantificaron el efecto citopático y las actividades de hemólisis, hemaglutinación (HA) y neuraminidasa (NA). En cultivo celular la cepa PAC1 presentó una mayor actividad fusogénica, sin embargo PAC3 presentó la mayor actividad citolítica. La cepa PAC3 fue la primera en ser detectada en sobrenadante de células infectadas (HA, NA y genoma), lo que muestra que sus viriones son liberados al medio antes que las otras dos cepas. PAC3 tuvo las actividades más altas de HA y NA, sin embargo, PAC1 presentó una mayor termoestabilidad en estas actividades de HN y un perfil de substrato algo distinto de los observados para LPM y PAC3. Estos datos sugieren que la actividad de NA está relacionada con la virulencia del RVP.

Implementación de dos metodologías diagnósticas para la determinación del virus de influenza porcina / Improvement of two diagnostics methods for detection of influenza swine virus

La influenza porcina, es una enfermedad respiratoria aguda viral altamente contagiosa, de morbilidad elevada y capaz de provocar complicaciones letales. Tiene gran importancia en la industria pecuaria debido a las cuantiosas pérdidas económicas que ocasiona su alta morbilidad. Por esta razón, en este trabajo se implementaron las pruebas de cultivo celular y RT-PCR para las proteínas M, H y N para la determinación del virus de influenza porcina. En este trabajo, se procesaron y analizaron 82 muestras de hisopos nasales, 12 lavados broncoalveolares y 12 tejidos pulmonares, dando resultados negativos para la detección del virus de influenza. Al comparar la RT-PCR de la proteína M con la de cultivo celular como "Gold Standard" se obtuvo una sensibilidad y especificidad del 100% e índice Kappa de 1, indicando una concordancia muy buena entre las dos pruebas.

The swine influenza virus, is an acute disease that affects the respiratory tract of the pig, It is highly contagious and have a raised morbility ratio also could turn into a fatal end. This disease has a very important roll into the pig production farms since it is a cause of loses of funds. For that reason, this work implemented the cell culture technique and RT-PCR for M, H and N proteins segments for the fast and accurate diagnosis of this virus. On this work, were tested 82 nasal swabs, 12 broncoalveolars washes, and 12 lung tissues, given negative results for the swine influenza virus. During the compilation of RT-PCR for M protein segment with the cell culture as a gold standard, it attained a sensibility and specificity of 100% and Kappa index of 1 indicating a good concordance between the two probes.

Clonagem, sequenciamento, expressão e caracterização do gene tsh de uma cepa de Escherichia coli patogênica de aves / Cloning, sequencing, expression, and characterization of the tsh gene from an avian pathogenic Escherichia coli strain

A hemaglutinina temperatura sensível (Tsh) pertence à família das serino-proteases autotransporte de Enterobacteriacea (SPATE), as quais são capazes de clivar diferentes substratos. Nós isolamos e caracterizamos o gene de Escherichia coli patogênica aviária (APEC) amostra APEC 13, sorotipo O2:H9, clonado em pET 101. A região de 4.2 kb do DNA clonado codificou uma proteína de aproximadamente 140 kDa (r-Tsh). O plasmídio recombinante pET 101-tsh conferiu um fenótipo de hemaglutinação positivo para a linhagem BL21 (tsh) para eritrócitos de galinha. A proteína r-Tsh foi purificada em coluna de níquel e utilizada na produção de anticorpos anti-Tsh. Um fragmento de 1.6 kb foi amplificado e subclonado em pCR4, e a seqüência parcial mostrou alta homologia com outras seqüências analisadas. O anti-Tsh reagiu com as proteínas r-Tsh e Tsh nativa da amostra APEC13, como demonstrado pela técnica de Western blot, mostrando que a r-Tsh tem epitopos conservados e que sua antigenicidade foi preservada. O anti-Tsh também inibiu a atividade hemaglutinante das amostras APEC 13 e BL12/pET 101-tsh

The temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) belongs to a family of high-molecular-weight serineprotease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs), which can cleave different substrates. Weisolated and characterised the tsh gene from an avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strain, APEC13serotype O2:H9, which was cloned in pET101. The 4.2 kb region of cloned DNA coded one protein ofapproximately 140 kDa (r-Tsh). The recombinant plasmid pET101-tsh conferred to E. coli BL21 strain(tsh) the hemagglutination-positive phenotype against chicken erythrocytes. The r-Tsh was purified byNi-NTA column and used to produce antibody anti-Tsh. A 1.6 kb fragment of the tsh sequence was alsoamplified and cloned in pCR4, and a partial sequence showed high homology with other sequenceanalysed. The anti-Tsh reacted with the protein r-Tsh and native Tsh of APEC13, as demonstrated byWestern blot, showing that r-Tsh has conserved epitopes and that its antigenicity was preserved. Theanti-Tsh also inhibited the hemagglutinating activity of strains APEC13 and BL21/pET101-tsh

Hemagglutinating properties of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources

Twenty-five strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources were examined for hemagglutinating activity. Bacteria cultured in different media induced hemagglutination of human erythrocytes, but no reaction was observed with erythrocytes from other animal species. The hemagglutinating expression activity was better for cultures on CFA agar at 37ºC than other conditions examined. The hemagglutination was inhibited by D-mannose, D-mannitol, melibiose, D-raffinose, L-rhamnose and sucrose. The absence of cell-surface appendages in electron microscope examinations suggested a nonfimbrial hemagglutinin. The data suggest that Salmonella Enteritidis produces nonfimbrial mannose-sensitive hemagglutinin, specific for human erythrocytes, which could be extracted in soluble form.

Foram estudadas 25 amostras de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis isoladas de diferentes fontes, em testes de hemaglutinação. Amostras bacterianas cultivadas em diferentes meios de cultura causavam hemaglutinação na presença de hemácias humanas, entretanto, não foi observada reação com hemácias de outras espécies. A expressão da atividade hemaglutinante foi melhor em ágar CFA a 37ºC. A hemaglutinação foi inibida por D-manose, D-manitol, melibiose, D-rafinose, L-ramnose e sacarose. A análise ultraestrutural não revelou a presença de estruturas filamentosas na superfície bacteriana, sugerindo que a hemaglutinina de Salmonella Enteritidis seja de natureza não fimbrial. Os dados sugerem que Salmonella Enteritidis produz uma hemaglutinina não fimbrial manose-sensível, específica para hemácias humanas, que pode ser extraída na forma solúvel.