Assessment of the acid phosphatase CP01850 from Corynebacterium pseudotuberculosis in DNA and subunit vaccine formulations against caseous lymphadenitis / Avaliação da fosfatase ácida recombinante CP01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis em formulações vacinais de subunidade e de DNA contra a linfadenite caseosa

The target cp1002_RS01850 from Corynebacterium pseudotuberculosis was used to construct a DNA and recombinant subunit vaccine against caseous lymphadenitis. Recombinant protein rCP01850 was expressed in Escherichia coli using pAE vector, and DNA vaccine was engineered with pTARGET vector. BALB/c mice were divided in five groups containing eight animals each, inoculated with: pTARGET/cp01850 as DNA vaccine (G1); rCP01850 plus Al (OH)3 as recombinant subunit vaccine (G2); pTARGET/cp01850 and a boost with rCP01850 plus Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); or Al (OH)3 (G5). Mice were inoculated and blood samples were collected on days 0, 21, and 42 for the analysis of total IgG, IgG1 and IgG2a by ELISA. In each group, five animals were challenged with Mic-6 C. pseudotuberculosis strain, and three were used for cytokine quantification by qPCR. Although no group has been protected by vaccines against lethal challenge, G2 showed an increase in the survival rate after challenge. Significantly higher levels of IL-4, IL-12, IFN-γ, total IgG, IgG1 and IgG2a were also detected for G2, evidencing a mixed Th1/Th2 immunological profile. In conclusion, despite no protection level provided by different vaccinal strategies using cp1002_RS01850 from C. pseudotuberculosis, G2 developed a Th1/Th2 immune response with an increase in survival rate.(AU)

O alvo cp1002_RS01850 de Corynebacterium pseudotuberculosis foi utilizado para construir uma vacina recombinante de subunidade e de DNA contra a linfadenite caseosa. A proteína recombinante rCP01850 foi expressa em Escherichia coli usando o vetor pAE, e a vacina de DNA foi construída com o vetor pTARGET. Camundongos BALB/c foram divididos em grupos de oito animais, inoculados com: pTARGET/cp01850 como vacina de DNA (G1); rCP01850 e Al (OH)3 como vacina recombinante de subunidade (G2); pTARGET/cp01850 e um boost com rCP01850 e Al (OH)3 (G3); pTARGET (G4); ou Al (OH)3 (G5). Os animais foram inoculados e amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 21, e 42 do experimento para a análise de IgG total, IgG1 e IgG2a por ELISA. De cada grupo, cinco animais foram desafiados com a cepa Mic-6 de C. pseudotuberculosis, e três foram usados para a quantificação de citocinas por qPCR. Apesar de nenhum grupo ter sido protegido pelas vacinas testadas contra o desafio letal, G2 apresentou taxa de sobrevida e níveis de IL-4, IL-12, IFN-γ, IgG total, IgG1 e IgG2a significativamente mais altos, evidenciando um perfil imunológico misto Th1/Th2. Conclui-se que apesar das diferentes estratégias vacinais utilizando cp1002_RS01850 de C. pseudotuberculosis não terem sido capazes de gerar proteção, G2 desenvolveu uma resposta Th1/Th2 e elevou a taxa de sobrevida.(AU)

Condiciones de adsorción de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa derivada de Salmonella Paratyphi A en adyuvantes de aluminio / Adsorption conditions of a vacunal candidate based on outer membrane vesicles of Salmonella Paratyphi A in aluminum adjuvants

La capacidad inmunoestimuladora de la mayoría de las vacunas es potenciada mediante la adsorción en adyuvantes que contienen aluminio. Variando las condiciones de adsorción (pH, tiempo de adsorción) cambia la cantidad de antígeno adsorbida y por lo tanto la capacidad de estimulación del sistema inmune. El Instituto Finlay de Vacunas investiga un nuevo candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A (VME-SPA). El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones de adsorción de las VME-SPA en dos adyuvantes de sales de aluminio (Al(OH)3 y AlPO4). Para ello, las VME-SPA fueron adsorbidas en ambos adyuvantes bajo diferentes condiciones de pH y tiempo. Mediante la construcción de una Isoterma de Langmuir se determinaron parámetros como la capacidad adsortiva (qm) y el coeficiente de adsorción (Kd). El lote de VME-SPA empleado estaba formado por poblaciones de nanoestructuras con un tamaño de partículas entre 60 y 100 nm. La adsorción de las VME-SPA en ambos adyuvantes, mostró valores ≥95 por ciento a pH neutro (6,5-7,0). Las VME-SPA en presencia de AlPO4 alcanzaron el estado de equilibrio en menor tiempo (99 por ciento a partir de 30 min) en comparación con Al(OH)3 (95 por ciento a partir de 3 h). Las isotermas evaluadas para ambos adyuvantes cumplieron con el modelo de Langmuir (R2≥0,99), con valores de qm y Kd diferentes entre los sistemas de adsorción. El estudio demostró que las VME-SPA se adsorbieron satisfactoriamente en ambos geles, proceso en el que están involucrados diferentes mecanismos de adsorción(AU)

The immunostimulation capacity of most vaccines is enhanced through antigen adsorption on aluminum adjuvants. The changes in adsorption conditions (pH, adsorption time), could change the amount of antigen adsorbed and therefore the ability to stimulate the immune system. The Finlay Institute of Vaccine researches a new vaccine candidate based on outer membrane vesicle from Salmonella Paratyphi A (OMV-SPA). The study aim was to determine adsorption condition of OMV-SPA with two aluminium adjuvants (Al(OH)3 and AlPO4). OMV-SPA was adsorbed in both adjuvants under differences conditions of pH and time. Parameters as adsorptive capacity (qm) and adsorption coefficient (Kd) were determined by construction of Langmuir Isotherm. The lot of OMV-SPA used is composed by population of nanostructure with a particle size between 60 and 100 nm. Adsorption of OMV-SPA in both adjuvants showed values ≥95 percent in neutral pH (6.5-7.0). OMV-SPA with AlPO4 got equilibrium state in less time (99 percent from 30 min) compared with Al(OH)3 (95 percent from 3 h). Isotherms from both adjuvants described Langmuir model (R2≥0.99), with qm and Kd values very different between adsorption systems. As conclusion, the study showed that OMV-SPA was adsorbed satisfactorily in both aluminium adjuvants, process in which are involved different adsorption mechanism(AU)

Characterizatio of the adsorption process analogous peptides on alumina gel / Carcterización ddelproceso de adsorción de péptidos análogos sobree gel de alúmina / Caracterização do processo de adsorção peptídeos análogos em gel alumnaa

Peptide antigen adsorption on aluminum hydroxide gel must be characterized when formulating vaccines. In this work a peptide belonging to the amino-terminal region of Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein and its analogues have been characterized. The adsorption of 17 analogues on aluminum hydroxide which had greater than 10 mmol/L solubility was quantified at 298 K. Adsorption capacity and affinity constant parameters were calculated by applying the Langmuir's adsorption model. The results have been presented in three groups according to adsorption isotherm trajectory. The first group consists of analogues where the first organization of peptide molecules was presented at low concentrations, followed by a rapid increase in adsorption to high concentrations. The second group consists of analogues having an adsorption pattern showing the formation of a first layer at low peptide concentrations and a second layer at greater concentrations. The third group contains analogues whose adsorption involved the formation of two simple layers, this being differentiated from the second group in that after the second layer had been completed, the amount adsorbed grew notably with increased concentration. The results revealed a more complex pattern that monolayer or bilayer formation. This work constitutes the first approach towards establishing an adsorbed layer structure model using a peptide system.

La adsorción de un antígeno peptídico sobre gel de hidróxido de aluminio debe ser caracterizada para la formulación de vacunas. En este trabajo se caracterizó la adsorción de un péptido que pertenece a la región amino-terminal de la proteína de superficie del merozoite de Plasmodium falciparum y sus análogos. Se cuantificó la adsorción a 298 K sobre hidróxido de aluminio de 17 análogos con una solubilidad mayor de 10 mmol/L. Los parámetros de capacidad de adsorción y constante de afinidad se calcularon aplicando el modelo de adsorción de Langmuir. Los resultados se presentan en tres grupos, de acuerdo con la trayectoria de la isoterma de adsorción. El primer grupo consta de los análogos que presentaron la primera organización de las moléculas de péptido en concentraciones bajas, seguida de un rápido incremento de la adsorción a altas concentraciones. El segundo grupo de análogos tiene un patrón de adsorción que muestra la formación de una primera capa a concentraciones bajas de péptido y una segunda capa a concentraciones mayores. El tercer grupo contiene los análogos cuya adsorción muestra la formación de dos capas simples y se diferencia del segundo grupo en que después de la segunda capa, la cantidad adsorbida crece notablemente con el aumento de la concentración. Los resultados revelaron un patrón de adsorción más complejo que la formación de monocapa o bicapa. Este trabajo constituye la primera aproximación hacia el establecimiento de un modelo de estructura de la capa adsorbida en un sistema peptídico.

A adsorção de um antígeno peptídico sobre um gel de hidróxido de alumíniodeve de ser caracterizado para a formulação de vacinas. Neste estudo foi caracterizada a adsorção de um peptídeo que pertence á região amino-terminal da proteína de superfície do merozoito de Plasmodium falciparum e seus análogos. Foi quantificada a adsorção a 298 K sobre hidróxido de alumínio de 17 análogos com uma solubilidade maior de 10 mmol/L. Os parâmetros de capacidade de adsorção e constante de afinidade foram calculados aplicando o modelo de adsorção de Langmuir. Os resultados sãoapresentados em três grupos de acordo á trajectória da isoterma de adsorção. O primeiro grupo consta dos análogos que apresentaram a primeira organização das moléculas de peptídeoem concentraçõesbaixas, seguido de um rápido incremento da adsorção a altas concentrações. O segundo grupo de análogos tem um padrão de adsorção que mostra a formação de uma primeira camada a concentraçõesbaixas de peptídeo e uma segunda camada a concentraçõesmaiores. O terceiro grupo contém os análogos cuja adsorçãomostra a formação de duas camadas simples e é diferenciado do segundo grupo em que depois da segunda camada, a quantidade adsorvida cresce notavelmente com o aumento da concentração. Os resultados revelaram um padrão de adsorçãomais complexo que a formação de monocamada ou bicamada. Este trabalho constitui a primeira aproximaçãoao estabelecimento de um modelo de estrutura da camada adsorvida num sistema peptídico.

Producción de anticuerpos policlonales IgG contra una proteína con actividad de óxido nítrico sintetasa de Toxoplasma gondii recombinante (NOS-Tg-r) y marcación inmunológica en taquizoítoso / Production of Polyclonal Antibodies against Toxoplasma gondii Recombinant protein with Nitric Oxide Synthase activity and immunologic marking in Tachyzoites

La enzima óxido nítrico sintetasa ha sido estudiada en mamíferos; en los últimos años se ha descrito que existe también en protozoos, pero se desconocen aspectos importantes de su función. Se logró producir anticuerpos policlonales contra la proteína recombinante con actividad de óxido nítrico sintetasa (NOS-Tg-r) de Toxoplasma gondii y realizar marcación inmunológica en taquizoítos. Se usaron dos conejos Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)que se inmunizaron por vía intramuscular con NOS-Tg-r, y dos tipos de adyuvantes, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Se comprobó la presencia de anticuerpos policlonales con la técnica de ensayo inmunoenzimático indirecto. Los resultados obtenidos mostraron que a NOS-Tg-r con adyuvante de Freund indujo mayor respuesta inmune que la de la NOS-Tg-r con hidróxido aluminio p 0,005). Para verificar si había reacción cruzada, se realizó una prueba ELISA utilizando como antígenos: metaloproteasa de T. gondii recombinante, cisteína proteasa 5 de Entamoeba histolytica recombinante, albúmina al 2%, hidróxido de aluminio y adyuvante de Freund. Los valores obtenidos con sueros preinmunes y contra proteínas alternas no superaron el punto de corte (0,069), lo cual indica que los anticuerpos policlonales obtenidos son específicos para NOS-Tg-r. Se realizó marcación inmunológica en taquizoítos de Toxoplasma gondii con inmunofluorescencia indirecta que mostró una marcación difusa a nivel de citoplasma y confirmó la presencia de esta proteína en los taquizoítos.

The nitric oxide synthase (NOS)is an enzyme well described on mammals but little is known about the role of these enzymes on pathogenic parasites. We produced polyclonal antibodies against a recombinant NOS enzyme from Toxoplasma gondii nd e lso er formed n mmunol locali zation of the enzyme on tachyzoites. We used two New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) to perform intramuscular immunization and we used two types of adjuvant: aluminum hydroxide and Freund ’s adjuvant. We tested the generation of polyclonal antibodies by an indirect ELISA assay. The results showed that levels of antibodies were higher in rabbits immunized with Freund ’s adjuvant than with aluminum hydroxide (p =0.005). In order to test cross reactions, we used a recombinant Toxoplasma metallooprotease, a recombinant cysteine protease from Entamoeba histolytica, albumin 2%, hydroxide aluminium and Freund ’s adjuvant as antigens on indirect ELISA assays for the polyclonal serum antibodies. No serum showed absorbances higher than the cutoff level with these antigens, indicating that the polyclonal antibodies were specific for recombinant Toxoplasma NOS. Additionally, we performed immunodetection of the enzyme on Toxoplasma gondii tachyzoites and we obtained a diffuse labeling of the parasite.

Peptide solubiltty, structure and charge position effect on adsorption by aluminium hydroxide / Efcto de la soluubilidad, la estructura y la posición de cargas de un péptido en la adsorción sobre hidróxido de alumiioo

Solubility, structure and position of charges in a peptide antigen sequence can be mentioned as being amongst the basic features of adsorption. In order to study their effect on adsorption, seven analogue series were synthesized from a MSP-1 peptide sequence by systematically replacing each one of the positions in the peptide sequence by aspartic acid, glutamic acid, serine, alanine, asparagine, glutamine or lysine. Such modifications in analogue peptide sequences showed a non-regular tendency regarding solubility and adsorption data. Aspartic acid and Glutamic acid analogue series showed great improvements in adsorption, especially in peptides where Lysine in position 6 and Arginine in position 13 were replaced. Solubility of position 5 analogue was greater than the position 6 analogue in Aspartic acid series; however, the position 6 analogue showed best adsorption results whilst the Aspartic acid in position 5 analogue showed no adsorption in the same conditions. Nuclear Magnetic Resonance structural analysis revealed differences in the -helical structure extension between these analogues. The Aspartic acid in position 6, located in the polar side of the helix, may allow this analogue to fit better onto the adsorption regions suggesting that the local electrostatic charge is responsible for this behavior.

La solubilidad, la estructura y la posición de las cargas en una secuencia de un péptido antígeno, se encuentran entre las características básicas de la adsorción. Con el fin de estudiar su efecto sobre la adsorción, fueron sintetizadas siete series de análogos de la secuencia de un péptido de la proteína MSP-1, reemplazando sistemáticamente cada una de las posiciones en la secuencia del péptido por ácido aspártico, ácido glutámico, serina, alanina, asparagina, glutamina o lisina. Las modificaciones en las secuencias de los péptidos análogos no mostraron tendencias regulares respecto a los datos de solubilidad y adsorción. Las series de análogos de ácido aspártico y ácido glutámico presentaron grandes incrementos en la adsorción, en especial cuando fueron reemplazadas la lisina de la posición 6 y la arginina de la posición 13. La solubilidad del análogo en posición 5 fue mayor que la del análogo en posición 6 en la serie del ácido aspártico; sin embargo, los mejores resultados en adsorción se obtuvieron al sustituir con ácido aspártico la posición 6, mientras que el análogo con el ácido aspártico en la posición 5 no presentó adsorción a las mismas condiciones. El análisis estructural por resonancia magnética nuclear mostró diferencias en la extensión de la estructura helicoidal entre estos análogos. El ácido aspártico en la posición 6, localizado en la cara polar de la hélice, podría permitir a este análogo ajustarse mejor sobre los sitios de adsorción, sugiriendo que la carga electrostática local es la responsable de este comportamiento.