ABSTRACT
Resumen En Colombia son escasas las técnicas de diagnóstico implementadas con biomarcadores inmunohistoquímicos para realizar biomonitoreo de contaminación ambiental. Objetivo: Implementar una técnica inmunohistoquímica para inmunolocalizar CYP 1A en tejidos de peces, luego de realizar un experimento de exposición subaguda al Clorpirifos en tilapias juveniles machos. Métodos: el experimento de dosis subletal, se realizó en un sistema semiestático, con recambio diario del 50% del volumen de agua manteniendo la concentración correspondiente en cada grupo experimental mediante la adición de la mitad de la dosis hasta el día 28. Las concentraciones de Clorpirifos para la exposición fueron 4, 8, y 12 μg/L, en los grupos tratados y 0,0 μg/L en el grupo control. Se tomaron muestras para estudio histopatológico e inmunohistoquímico. Resultados: se encontró diferencia significativa (p<0,05) para algunas lesiones en el hígado, confirmando que este es un órgano de impacto de los efectos del Clorpirifos a bajas dosis. Se verificó la inducción de CYP 1A en el hepatocitos, endotelio y células biliares tanto de los animales expuestos como en los no expuestos. Desde el punto de vista multidimensional no se encontró diferencia estadística entre los tratamientos para las variables estudiadas. Conclusión: se implementó y normalizó una técnica de inmunohistoquímica para la inmunolocalización tisular de CYP 1A, que podrá utilizarse en futuras investigaciones para realizar biomonitoreo de contaminación en las cuencas hidrográficas de Colombia.
Abstract In Colombia the diagnostic techniques for implementing immunohistochemical biomarkers to fulfill biomonitoring of environmental contamination are limited. Objective: To implement an immunohistochemical technique to immunolocate CYP 1A in the tissue of fish, performing a subacute exposition experiment of Clofopirifos in the liver of young male tilapia. Methods: the sublethal dosage was carried out in semi-static state, with a daily refill of 50% of the water volume, maintaining the corresponding concentration in each group through the addition of half of the dosage until the 28th day. The Cloropirifos concentrations for the exposition were 4, 8, and 12 μg/L in the treated groups and 0.0 μg/L in the control group. Samples were taken for histopathological and immunohistochemical study. Results: A significant difference (p<0.05) for some liver lesions, confirming that it is an organ affected by low dosages of Cloropirifos. It verified that the induction of CYP 1A in hepatocyte, endothelium and biliary cells equally in exposed animals and those that weren't exposed. From a multidimensional perspective, no statistical difference was found between the treatments for the variables under study. Conclusion: this study implemented and normalized an immunohistochemical technique for the tissue immunolocation of CYP 1A that could be used in future investigations to fulfill biomonitoring of contamination in Colombia's hydrographic basins.
Resumo Na Colômbia são escassas as técnicas de diagnóstico realizadas com biomarcadores imuno-histoquímicos para realizar biomonitoramento da contaminação ambiental. Objetivo: Estandardizar uma técnica imuno-histoquímica para fazer imunolocalização do CYP 1ª em tecidos de peixes, logo de realizar um experimento de exposição subaguda ao Clorpirifós em machos juvenis de tilápia. Métodos: O teste da dose subletal realizou-se num sistema semiestático, com recambio diário de 50% do volume de água mantendo a concentração correspondente em cada grupo experimental mediante a adição da metade da dose até o dia 28. As concentrações de Clorpirifós para a exposição dos peixes foram 4, 8 e 12 μg/L, nos grupos tratados e 0,0 μg/L no grupo controle. Tomaram-se amostras para o estudo histopatológico e imuno-histoquímico. Resultados: Encontrou-se diferença significativa (p<0.05) para lesões no fígado, confirmando que este é um órgão que recebe diretamente o impacto dos efeitos do Clorpirifos em baixas doses. Verificou-se a indução de CYP 1A nos hepatócitos, endotélio e células biliares tanto nos animais que estiveram expostos ao Clorpirifós quanto nos animais que não estiveram expostos. Desde o ponto de vista multidimensional não se encontrou diferença estadística entre os tratamentos para as variáveis estudadas. Conclusão: Estandardizou-se e normalizou-se uma técnica de imuno-histoquímica para a imunolocalização tissular de CYP 1A, que poderá se utilizada em futuras pesquisas para realizar biomonitoramento da contaminação das bacias hidrográficas da Colômbia, além disto.
ABSTRACT
Chlorpyrifos is a highly toxic insecticide to freshwater organisms and little is known regarding its potential to affect endocrine systems at sublethal concentrations. The induction of vitellogenin (Vtg) is a fairly sensitive marker of the effects of estrogenic compounds in juvenile fish. Objective: to evaluate histological changes and Vtg production in juvenile male tilapia (Oreochromis spp) exposed to sublethal concentrations of the insecticide Lorsban® EC (active ingredient chlorpyriphos). Methods: juvenile tilapia were exposed to 4, 8, and 12 μg/L of chlorpyrifos for 28 days in a semistatic system, with tanks receiving a 50% (v/v) daily water change to maintain nominal concentrations of the insecticide throughout the experiment. Subgroups of 3 animals from each concentration batch were euthanized on days 7, 14, 21 and 28 days, and samples of liver, gonads, gills, kidney and brain tissues were taken for routine histopathology examination. Liver and gonads were also processed by immunohistochemistry using monoclonal antikillifish vitellogenin Vtg ND - 5F8 to detect Vtg. Results: we found significant statistical difference (p<0.05) for some injuries to the brain (degeneration and gliosis of the optic tectum), kidneys (vacuolar nephrosis and tubular hyaline granules), and liver (karyomegaly, binucleation, and hyaline granules in hepatocytes). Similarly we verified the induction of vitellogenin synthesis in liver and gonads, finding significant difference (p<0.05) in the expression of this protein between the control group and 4 mg / L with respect to treatment of 8 and 12 mg / L. Conclusion: the results obtained on the induction of vitellogenin in males suggest a general effect of blocking concentrations of Chlorpyrifos for the possible induction of this protein. The mechanisms are not known at this time.
Hasta donde se conoce, no hay estudios en tilapias juveniles (Oreochromis spp), que valoren el potencial de disrupción endocrina del Clorpirifos por análisis histológico e inmunohistoquímico de la inducción de la Vitelogenina (Vtg) hepática. Objetivo: determinar los efectos de la exposición subaguda al Clorpirifos en órganos blanco de disrupción en peces juveniles machos de tilapia. Métodos: el experimento de dosis subletal, se realizó en un sistema semiestático, con recambio diario del 50% del volumen de agua manteniendo la concentración nominal en cada grupo experimental mediante la adición de la mitad de la dosis hasta el día 28. Las concentraciones de Clorpirifos para la exposición fueron 4, 8, y 12 μg/L. Con cada concentración se trataron 12 juveniles, con tres replicas para cada concentración. Los 12 peces del grupo control no recibieron tratamiento. Se realizó el estudio anatomopatológico de tres animales por grupo, por cada semana los días 7, 14, 21 y 28 de estudio. Se efectuó la toma de muestras para estudio histopatológico de hígado, gónadas, branquias, riñón y encéfalo y se procesaron por histopatología de rutina. Las muestras de hígado y gónada también se procesaron por inmunohistoquímica. Resultados: el análisis MANOVA encontró diferencia significativa (p<0.05) para lesiones en encéfalo (degeneración tectum óptico), riñón (gránulos hialinos) e hígado (cariomegalia), constituyéndose en órganos de impacto de los efectos del Clorpirifos a bajas dosis. Se verificó la inducción de Vtg en hígado y gónada de los animales expuestos, encontrando diferencia estadística significativa (p<0.05) en la expresión de esta proteína entre el grupo control y de 4 μg/L con relación a los grupos de 8 y 12 μg/L. Conclusión: los resultados obtenidos sobre la inducción de Vtg en machos sugieren un efecto antogonista del Clorpirifos sobre los Receptores Estrogénicos (REs), con una posible disminución en la síntesis de ésta proteína. Los mecanismos no se conocen en el momento.
O clorpirifos é um insecticida altamente tóxico para os organismos de água doce. Porém, pouco se sabe acerca de seu potencial efeito no sistema endócrino em concentrações subletais. A indução de vitelogenina hepática (Vtg) é um marcador bastante sensível do efeito de componentes estrogênicos em peixes juvenis. Objetivo: determinar os efeitos da exposição subaguda ao clorpirifos em órgãos alvo de disrupção endócrina em machos juvenis de tilápia. Métodos: o experimento foi realizado em um sistema semi-estático com recambio diário de 50% do volume de água, com manutenção da concentração nominal em cada grupo experimental mediante a adição da metade da dose de clorpirifos até o dia 28. Três grupos de 12 peixes foram tratados com concentrações de clorpirifos de 4, 8 y 12 μg/L, respectivamente, com três réplicas para cada grupo. Um grupo controle não recebeu nenhum tratamento. Realizou-se o estudo anatomopatológico de rotina do fígado, gônadas, brânquias, rins e encéfalo de três animais por grupo nos dias 7, 14, 21 e 28. As amostras de fígado e gônada foram também processadas por inmunoistoquímica usando um anticorpo monoclonal para detectar Vtg (anti-killifish Vtg ND-5F8). Resultados: mediante análise MANOVA encontrou-se diferença significativa (p<0.05) para lesões no encéfalo (degeneração do tectum óptico), rim (grânulos hialinos) e fígado (cariomegalia), fato que demonstra que estes são os órgãos alvo dos efeitos do clorpirifos a baixas doses. Verificou-se a indução de Vtg no fígado e gônada dos animais expostos, com diferença estatística significativa (p<0.05) na expressão desta proteína entre o grupo controle e o grupo de 4 μg/L com relação aos grupos de 8 e 12 μg/L. Conclusão: os resultados obtidos sobre a indução de Vtg em machos sugerem um efeito antagonista do clorpirifos sobre os receptores estrogênicos, com uma possível diminuição na síntese desta proteína. Os mecanismos ainda são desconhecidos.