Mieloma múltiple con IgM de superficie precedido por síndrome mielodisplásico en paciente anciana / Surface membrane IgM multiple myeloma preceded by myelodysplastic syndrome in an elderly patient

Introducción: El mieloma múltiple con expresión de inmunoglobulina M de superficie constituye una enfermedad rara cuya causa es desconocida y se caracteriza por una alta tasa de anormalidades genéticas en las células plasmáticas o sus precursores. Objetivo: Determinar las características clínicas y sus asociaciones con la expresión inmunofenotípica de inmunoglobulina M de superficie e inmunohistoquímica de CD20 en una paciente afectada de mieloma múltiple precedido por síndrome mielodisplásico. Presentación del caso: Paciente femenina, 68 años de edad. Admitida en el Servicio de Hematología Clínica. Al momento del diagnóstico presentó palidez, trombocitopenia, hipercalcemia y lesiones óseas. Inicialmente, mediante citometría de flujo se detectaron patrones aberrantes para granulocitos, neutrófilos, monocitos y serie eritroide, sugerentes de síndrome mielodisplásico. Posteriormente se observó aumento de las células plasmáticas del 18 % en el frotis de médula ósea, exhibiendo una morfología similar a linfocitos. Se reportó una población patológica de 6 % de la celularidad total, mostrando positividad para CD38, CD117 e inmunoglobulina M de superficie, negatividad para CD19 y CD45, fenotipo coherente con células plasmáticas anormales. Adicionalmente resultados de inmunohistoquímica relataron tinción difusa de CD20 en biopsia de médula ósea. La paciente logró recuperarse luego de un trasplante autólogo de células progenitoras hematopoyéticas. Conclusión: Los resultados resaltan la importancia de diagnosticar y monitorear casos únicos que permitan un tratamiento oportuno del paciente.

Introduction: Multiple Myeloma with expression of surface immunoglobulin M is a rare entity, whose cause is unknown, and is characterized by a high rate of genetic abnormalities in plasma cells or their precursors. Objective: To determining the clinical characteristics and their associations with the immunophenotypic expression of surface immunoglobulin M and CD20 immunohistochemistry in a patient affected by Multiple Myeloma preceded by Myelodysplastic syndrome. Case presentation: A 68-year-old female patient is admitted to the Clinical Hematology Service. At the time of diagnosis, she presented pallor, thrombocytopenia, hypercalcemia, and bone lesions. Initially, flow cytometry detected aberrant patterns for neutrophilic granulocytes, monocytes, and the erythroid series suggestive of myelodysplastic syndrome. Subsequently, an 18% increase in plasma cells was observed in the bone marrow smear, exhibiting a lymphocyte-like morphology. A pathological population of 6% of the total cellularity was reported, showing positivity for CD38, CD117 and surface immunoglobulin M, negativity for CD19 and CD45, a phenotype consistent with abnormal plasma cells. Additionally, immunohistochemical results reported diffuse CD20 staining in bone marrow biopsy. The patient managed to recover after an autologous hematopoietic stem cell transplant. Conclusion: The results found highlight the importance of diagnosing and monitoring single cases that allow timely treatment of the patient.

Flow cytometry as a diagnostic tool in childhood solid tumors / Citometria de fluxo como ferramenta diagnóstica em tumores sólidos da infância

RESUMEN Los tumores sólidos infantiles representan aproximadamente el 30% de todos los cánceres pediátricos. En los últimos años se ha incrementado el uso de la citometría de flujo (CF) en el diagnóstico y seguimiento de estas patologías, ya que es un método que permite obtener resultados rápidos y precisos, posibilitando un manejo más precoz. Realizamos esta revisión sistemática para la búsqueda bibliográfica de los siguientes términos en las plataformas de datos Lilacs, PubMed y Scielo: neoplasma, oncología, pediatría, inmunofenotipificación y citometría de flujo. Así, describimos los principales hallazgos hasta la fecha sobre el uso de CF en el diagnóstico diferencial de los cinco principales tumores de células pequeñas, redondas y azules de la infancia: neuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor neuroectodérmico primitivo, tumor de Wilms y rabdomiosarcoma. Además, describimos las principales ventajas y desventajas del método y paneles que se proponen en el diagnóstico diferencial de estas patologías a través de la literatura internacional. A través de esta revisión, observamos que el uso de CF en el diagnóstico de tumores sólidos puede ser útil para la identificación rápida y precisa de la efermedade, así como para el inicio más temprano del tratamiento.

The importance of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / A importância da citometria de fluxo no diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna

ABSTRACT Introduction: The paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is an acquired clonal disease of the hematopoietic stem cells, and it is clinically characterized by chronic intravascular hemolysis, bone marrow failure and hypercoagulability leading to thrombosis. It is a rare disorder of the hematopoietic stem cells that occurs due to a somatic mutation in the gene phosphatidylinositol glycan class A (PIG-A). Objective: Here we reviewed the importance of screening and monitoring of individuals with high risk of developing PNH, since the early diagnosis of the disease is essential for better prognostic and treatment choice for the patient. Method: A review was carried out with great focus on the pathophysiology and diagnosis of PNH, mainly with the use of flow cytometry technique to detect the disease. Results: This gene codifies an enzyme essential to the formation of glycosylphosphatidylinositol (GPI), which acts as a molecular anchor for many membrane proteins. The alteration of GPI synthesis promotes a partial or complete loss of proteins that needs this molecular anchor to bind to the cell surface. Among these proteins are the CD55 and the CD59, which control the activation of the complement cascade. Conclusion: The immunophenotyping exam with flow cytometry is considered the reference test for PNH diagnosis, since the technique is highly sensitive and specific, presenting advantages as the quantitative identification of small populations of cells with PNH phenotype and the capacity to distinguish cells with partial or total deficiency of GPI-anchored proteins.

RESUMEN Introducción: La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad clonal adquirida de células madre hematopoyéticas; se caracteriza clínicamente por hemólisis intravascular crónica, insuficiencia medular e hipercoagulabilidad, que conduce a trombosis. Es un trastorno raro de las células madre hematopoyéticas que ocurre debido a una mutación somática en el gen fosfatidilinositol-glicano de clase A (PIG-A). Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo revisar la importancia del cribado y seguimiento de individuos con alto riesgo de desarrollar HPN, pues el diagnóstico precoz de la enfermedad es vital para un mejor pronóstico y la elección del tratamiento del paciente. Métodos: Se realizó una revisión con mayor enfoque en la fisiopatología y diagnóstico de la HPN. El foco principal de la investigación fue el uso de la técnica de citometría de flujo para detectar la enfermedad. Resultados: Ese gen codifica una enzima esencial en la formación de glicosilfosfatidil inositol (GPI), que actúa como molécula de anclaje para varias proteínas de membrana en las células hematopoyéticas. Cambiar la síntesis de GPI genera una pérdida parcial o total de proteínas que necesitan esta molécula de anclaje para unirse a la superficie celular. Entre esas proteínas se encuentran CD55 y CD59 presentes en los eritrocitos, que controlan la activación de la cascada del complemento. Conclusión: La técnica de inmunofenotipificación por citometría de flujo se considera la prueba de referencia para el diagnóstico de HPN, ya que es altamente sensible y específica, presenta ventajas como la identificación cuantitativa de pequeñas poblaciones de células con el fenotipo de HPN y la capacidad de distinguir células con deficiencia parcial o total de proteínas ancladas por GPI.

RESUMO Introdução: A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma enfermidade clonal adquirida de células-tronco hematopoiéticas; caracteriza-se clinicamente por hemólise intravascular crônica, falência medular e hipercoagulabilidade, levando a tromboses. É uma rara desordem das células-tronco hematopoiéticas que ocorre devido a uma mutação somática no gene fosfatidilinositol glicano classe A (PIG-A). Objetivo: Este trabalho teve como objetivo revisar a importância do rastreamento e monitoramento de indivíduos com alto risco de desenvolvimento da HPN, pois o diagnóstico precoce da doença é essencial para um melhor prognóstico e a escolha do tratamento para o paciente. Metodologia: Foi realizada uma revisão com mais enfoque na fisiopatologia e no diagnóstico da HPN. O foco principal da pesquisa foi o uso da técnica da citometria de fluxo para a detecção da doença. Resultados: Esse gene codifica uma enzima essencial na formação de glicosilfosfatidil inositol (GPI), a qual atua como molécula âncora de diversas proteínas de membrana nas células hematopoiéticas. A alteração da síntese de GPI gera uma perda parcial ou completa de proteínas que necessitam dessa molécula-âncora para se ligarem à superfície celular. Entre estas proteínas estão o CD55 e o CD59 presente em eritrócitos, que controlam a ativação da cascata do complemento. Conclusão: O exame de imunofenotipagem por citometria de fluxo é considerado o teste de referência para diagnóstico de HPN, pois a técnica é altamente sensível e específica, apresentando vantagens como a identificação quantitativa de pequenas populações de células com fenótipo HPN e a capacidade de distinguir células com deficiência parcial ou total de proteínas ancoradas pela GPI.

Diseño de un panel multicolor para evaluar moléculas intracelulares y de superficie mediante citometría de flujo / Design of a multicolor panel to assess intracellular and surface molecules by flow cytometry

Introducción. La citometría de flujo permite detectar la presencia de moléculas intracelulares y de superficie, de forma simultánea sobre cada célula. Objetivo. Describir un método para la construcción armónica de un panel multicolor con 11 parámetros para el análisis fenotípico y funcional de linfocitos T (LT) CD8 + por citometría de flujo. Materiales y métodos. Para la construcción del panel multicolor, se seleccionaron las moléculas y se titularon los conjugados con fluorocromos para la determinación de CD3, CD8, CCR7, CD28, CD27, CD45RA, CD95 y CD127, en células mononucleares de sangre periférica. Para la evaluación del panel, se hizo la construcción progresiva adicionando uno a uno los conjugados y la fluorescencia menos uno (FMO). Este método fue aplicado para células ex vivo y para evaluar la producción de IFN ? , IL-2 y TNFa frente al estímulo con la enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) y al antígeno crudo de Trypanosoma cruzi . Finalmente, se procedió al análisis de las subpoblaciones de LT CD8 + ex vivo en individuos sanos. Resultados. La evaluación de las moléculas con los conjugados no mostró interferencia en las señales de fluorescencia. Las frecuencias de las subpoblaciones de LT CD8 + evaluadas fueron cercanas a los valores reportados en otros estudios. Además, se observó que la frecuencia de LT CD8 + productores de IFN ? , IL-2 y TNFa fue mayor a las seis horas de cultivo con SEB y con el antígeno crudo de T. cruzi . Conclusiones. El método aplicado para la construcción del panel multicolor permite obtener frecuencias de las subpoblaciones de LT CD8 + que corresponden a lo reportado en la literatura científica.

Introduction: Flow cytometry allows simultaneous detection of surface and intracellular molecules on each cell. Objective: To describe a method for building up a harmonic multicolor panel with 11 flow cytometry parameters for phenotypic and functional analysis on CD8 + T lymphocytes. Materials and methods: For the multicolor panel construction, we selected the molecules and titred conjugated antibodies with fluorochromes for CD3, CD8, CCR7, CD28, CD27, CD45RA, CD95 and CD127 determination in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). To evaluate the panel, the conjugated antibodies were gradually added one by one and fluorescence minus one (FMO) test was performed. This method was applied to assess ex vivo subpopulations of T cells and the production of intracellular IFN ? , IL-2 and TNF a using polyclonal stimulation with enterotoxin B from Staphylococcus aureus (SEB) and antigen-specific cells with crude Trypanosoma cruzi antigen. Finally, the ex vivo CD8 + T lymphocyte subpopulations frequencies were analyzed in healthy individuals. Results: The evaluation of the selected molecules and conjugates did not show interference in the fluorescence signals and detection. The frequencies of CD8 + T cells evaluated were similar to the values reported in other studies. Additionally, we observed that the frequency of CD8 + T lymphocytes producing IFN ? , IL-2 and TNF a was higher 6 hours after culture with SEB and crude T. cruzi lysate. Conclusions: The method used for the construction of a multicolor panel allows obtaining frequencies of CD8 + T lymphocyte subpopulations corresponding to those reported in the literature.

Citometría de fuujo: vínculo entre la investigación básica y la aplicación clínica

La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. Una de las características analíticas más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad de medir múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad y, por supuesto, cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un fluorocromo. Las aplicaciones más relevantes de la citometría de flujo en la práctica médica se relacionan con la hematología e inmunología clínicas, midiendo parámetros como número y clasificación de células sanguíneas. Esta técnica es empleada también en el conteo de subpoblaciones de linfocitos en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de leucemias agudas y síndromes linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos. En los últimos 20 años, el análisis de enfermedades pulmonares de origen inmunológico por citometría de flujo ha jugado un papel importante en el entendimiento y diagnóstico de enfermedades como sarcoidosis, neumonía eosinofílica o neumonitis por hipersensibilidad. Las aplicaciones de la citometría de flujo son numerosas, lo cual ha permitido el empleo de estos instrumentos de manera amplia en los campos, tanto de la investigación biológica como médica. Esta revisión brinda un panorama general de los principios básicos de la citometría de flujo y la muestra como una herramienta reproducible y aplicable a una gran variedad de campos médicos, así como su empleo en el campo de las enfermedades pulmonares.

Flow cytometry is an analytical method that allows the rapid measurement of certain physical and chemical characteristics of cells or particles suspended in liquid and produce signals when they pass individually through a beam of light. An important analytical feature of flow cytometers is their ability to measure multiple cellular parameters such as cell size, shape and internal complexity and, of course any cell component or function that can be detected by a fluorescent dye. The most prominent uses of flow cytometry in medical practice are in the related fields of laboratory hematology and clinical immunology, for a variety of tasks involving blood cell counting and classification. This technique is also used for counting lymphocyte subpopulations in patients with HIV, characterization of acute leukemias and chronic lymphomas between other diseases. Over the last 20 years, analysis of immunologica lung diseases by flow cytometry has played a major role in the understanding and as tool of diagnosis, such as sarcoidosis, eosinophilic pneumonia or hypersensitivity pneumonitis. So the applications of flow cytometry are numerous, and this has lead to the widespread use of this instruments in biological research and medical fields. Overall this review shows a brief overview of basic principles of and shows this as a reproducible tool applicable to a wide range of medical approaches as well as its use in lung diseases field.