Fecal culture and two fecal-PCR methods for the diagnosis of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in a seropositive herd / Cultivo fecal y dos métodos de PCR en materia fecal para el diagnóstico de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en un hato seropositivo / Cultivo fecal e dois métodos de PCR em matéria fecal para o diagnóstico de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis em um rebanho soropositivo

Abstract Background: paratuberculosis is a slow-developing infectious disease, characterized by chronic granulomatous enterocolitis. This disease has a variable incubation period from 6 months to over 15 years, and is caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Its detection by direct and indirect diagnostic techniques has been of special interest. Objective: to report the diagnosis and detection of MAP using several diagnostic tests in a herd of the Northern region of Antioquia, Colombia. Methods: serum samples from the study herd were analyzed, using a commercial ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit. Fecal samples were cultured by duplicate using Herrold´s egg yolk medium (HEYM), and analyzed by an end- point IS900-specific nested PCR protocol, and a commercial F57-real-time PCR kit. Results: eight out of 27 serum samples in the study herd resulted ELISA-positive. None of fecal samples resulted positive to HEYM culture by duplicate and none were found to be positive by F57-real-time PCR. Seven of the 27 fecal samples were found to be positive by end-point IS900-specific nested PCR. Agreement was found between ELISA and end-point IS900-specific nested PCR in one of the animals. Conclusion: the present study gives information about the agreement between direct and indirect MAP-detection techniques, using different matrixes from animals under the same husbandry conditions.

Resumen Antecedentes: la paratuberculosis es una enfermedad infecciosa de desarrollo lento, caracterizada por una enterocolitis granulomatosa crónica. Esta enfermedad tiene un periodo de incubación que varía entre los 6 meses hasta por más de 15 años, y es causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Su detección por técnicas diagnósticas directas e indirectas ha sido de interés especial. Objetivo: reportar el diagnóstico y detección de MAP utilizando varias técnicas diagnósticas en un hato de la región norte de Antioquia, Colombia. Métodos: se analizaron las muestras de suero del hato de estudio utilizando un kit comercial de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Las muestras de materia fecal fueron cultivadas por duplicado en Herrold´s egg yolk medium (HEYM), y analizadas mediante un protocolo de PCR anidado específico de IS900 y un kit comercial de PCR en tiempo real para F57. Resultados: ocho de las 27 muestras de suero resultaron positivas por ELISA. Ninguna de las muestras de materia fecal resultó positiva al cultivo en HEYM por duplicado ni por PCR en tiempo real para F57. Siete de las 27 muestras de materia fecal resultaron positivas a PCR anidado específico de IS900. Se encontró concordancia entre el resultado de ELISA y de PCR anidado específico de IS900 en uno de los animales. Conclusión: el presente estudio brinda información acerca de la concordancia entre técnicas directas e indirectas de detección de MAP, utilizando diferentes matrices a partir de animales bajo las mismas condiciones de manejo.

Resumo Antecedentes: a paratuberculosis é uma doença infecciosa de evolução lenta, caracterizada por uma enterocolite granulomatosa crônica. Esta doença tem um período de incubação que varia de 6 meses a 15 anos e é causada pelo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Sua detecção por técnicas de diagnóstico diretos e indiretos tem sido de especial interesse. Objetivo: reportar o diagnóstico e a detecção de MAP utilizando várias técnicas de diagnóstico em um rebanho na região norte de Antióquia, Colômbia. Métodos: foram analisadas amostras de soro do rebanho utilizando um kit comercial de ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay). As amostras de fezes foram cultivadas em duplicado em Herrold´s egg yolk medium (HEYM) e analisadas utilizando um protocolo de PCR aninhada específico de IS900 e um kit de PCR em tempo real comercial para F57. Resultados: oito das 27 amostras de soro foram positivas para ELISA. Nenhuma das amostras testadas na cultura de fezes HEYM duplicado foram positivas ou na PCR em tempo real para F57. Sete das 27 amostras de fezes foram positivas na PCR aninhada específica para IS900. Foi encontrada concordância entre o resultado de ELISA e PCR aninhada específica para IS900 em um animal. Conclusão: este estudo fornece informações sobre a correlação entre técnicas de detecção direta e indireta do MAP, utilizando diferentes matrizes de animais sob as mesmas condições de condução.

Identifi cation of Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis by PCR techniques and establishment ofcontrol programs for bovine paratuberculosis in dairy herds / Identificación de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis mediante pruebas dePCR y definición de programa de control de la paratuberculosis bovina en hatos lecheros / Identificação de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis por PCR edefinição do programa de controle da paratuberculose em rebanhos bovinos leiteiros

The aim of this study was to establish the protocol of conventional and real time PCR for amplificationof Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) genome from bovine fecal samples, as a wayto define strategies for establishing a prevention and control program in a dairy herd at the Universidadde Antioquia (Medellín, Colombia). Fecal samples were individually taken of clinical healthy cows orcows with diarrhea bred in a herd enzootic for Johne’s disease, were processed them for culture in liquidMiddlebrook 7H9 media supplemented with mycobactin under two different protocols: with or withoutinhibitors. Fecal samples from clinically healthy cows were used as negative control. Conventional andreal time PCR were performed with MAP DNA obtained of fecal or cultured samples. The MAP- specificIS900 segment was amplified by using the respective forward and reverse primers. DNA isolated from areference MAP strain was used as positive control of PCR. Data were analyzed by descriptive statisticsand simple regression analysis between PCR and culture results were performed. All samples culturedin media with or without mycobactin gave a positive result compatible with MAP growth. However, only13,3% of samples were positive by real time PCR. There was no relationship neither between PCR and culture results, nor between clinical condition of the cow and MAP positivity. These results support theneed combine culture of feces with PCR diagnosis for identification of MAP-excreting cows in a dairyherd. Finally, a strategy of prevention and control of bovine paratuberculosis is proposed for this enzooticherd and for dairy herds in Colombia.

El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de detección y amplificación del Mycobacteriumavium paratuberculosis (MAP) a partir de muestras de materia fecal bovina, mediante el uso de la técnicade PCR en tiempo real, como estrategia de apoyo para el establecimiento de un programa de prevencióndetección y control de la paratuberculosis bovina en el hato lechero de la Universidad de Antioquia. Muestrasde materia fecal fueron tomadas de bovinos provenientes de un hato enzoótico para la enfermedad de Johne,fueron cultivadas en medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 suplementado con micobactina, bajo dosprotocolos de aislamiento: con o sin inhibidores. Como control negativo fue utilizada muestras de materiafecal de bovinos clínicamente sanos. Adicionalmente, con el DNA de las muestras aisladas en cultivo yde las muestras de materia fecal, fueron hechas pruebas de PCR convencional y en tiempo real, para laamplificación del elemento de inserción IS900 del MAP, mediante el uso de cebadores específicos para esteelemento. Como control positivo se utilizó DNA de MAP de una cepa de referencia. Los resultados fueronevaluados mediante estadística descriptiva y la comparación entre el resultado del cultivo y de la pruebade PCR fue evaluado mediante regresión simple. Los resultados del cultivo bacteriológico, mostraron untotal de 15 muestras con crecimiento compatible con MAP, el cual fue verificado por prueba de PCR enel 13.3% de los casos. No hubo correlación entre el resultado de cultivo y la prueba de PCR ni entre elestado clínico y la positividad al MAP. Los resultados confirman la necesidad de combinar el diagnósticomolecular con el cultivo bacteriológico para identificar las vacas positivas en un hato. Finalmente, unaestrategia de prevención y control de la enfermedad aplicable a este hato enzoótico y a los hatos lecherosen Colombia es discutida.

O objetivo deste estudo foi estabelecer um sistema de detecção e amplificação do Mycobacterium aviumparatuberculosis (MAP) a partir de amostras fecais bovinas, utilizando a técnica de PCR em tempo real,como uma estratégia para apoiar o estabelecimento de um programa rastreio para a prevenção e controlede la paratuberculosis bovina no rebanho leiteiro da Universidade de Antioquia. Foram colhidas amostrasde fezes de gado bovino a partir de uma fazenda enzoótica para a doença de Johne, e foram cultivadasem meio de cultura líquida Middlebrook 7H9 suplementado com micobactina, sob dois protocolos deisolamento: com ou sem inibidores. Foram utilizadas como controle negativo amostras fecais de bovinossaudáveis. Além disso, as amostras de DNA isoladas e cultivadas a partir de amostras fecais foramrealizadas testes de PCR convencional e em tempo real, para amplificação elemento de inserção IS900 noMAP. Foi utilizado como controle positivo do teste DNA de uma estirpe de referencia. Os resultados foramavaliados por estatística descritiva e as comparações entre os resultados de cultura e teste PCR foramavaliadas por regressão simple. Os resultados de cultura bacteriológica mostraram 100% de crescimentoem amostras com MAP, que foi verificada por PCR em 13,3% dos casos. Não houve correlação entre oresultado do cultivo e teste PCR ou entre a clínica e a positividade para MAP. Os resultados confirmam anecessidade de combinar o diagnóstico molecular com cultura bacteriológica para identificação positivade vacas em um rebanho. Finalmente, uma estratégia de prevenção e controle da doença aplicável nesterebanho enzoótico e os rebanhos leiteiros e na Colômbia é discutida.

Infección por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en un rebaño criollo limonero / Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in a criollo limonero herd

El objetivo de este estudio consistió en definir, analizar y evaluar la situación de un rebaño Criollo Limonero elite en relación a la paratuberculosis bovina. La investigación se llevó a cabo utilizando las variables epidemiológicas y el análisis de muestras (leche y suero) mediante inmunoensayo enzimático (ELISA) comercial. Posteriormente, se tomaron como base estos resultados y utilizando otras herramientas diagnósticas como la exploración clínica, tinción directa, cultivos, identificación mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y estudio histomorfológico, todas ellas dirigidas a confirmar el estado de la infección. Los resultados permiten aseverar la existencia de infección por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAsP) en tasas de positividad variable. La técnica de ELISA mostró alta capacidad en la identificación de animales subclinicamente afectados, lo que demuestra su potencial como prueba primaria de diagnóstico en el establecimiento de futuros programas de control. La técnica de amplificación por PCR reveló la presencia de genoma de subespecies de Mycobacterium avium, lo cual apoya fuertemente la presunción de infección en estos animales por MAsP, pese a la imposibilidad de lograr claras evidencias clínicas, clinicopatológicas, microbiológicas e histopatológicas que permitieran corroborar este dictamen. La estrecha correlación entre los resultados de ELISA y PCR, ratifica no sólo la confirmación diagnóstica, sino también validan los datos obtenidos a través de la prueba serológica.

The purpose of this research was to define, analyze and evaluate the situation of an elite Criollo Limonero herd related to bovine paratuberculosis. The investigation was carried out using the epidemiological variables and samples analysis (milk and serum) through a commercial enzyme immunoassay (ELISA). The results of the above test were taken as a foundation to use other diagnostic tools, such as clinical examination, direct staining, bacterial culture, identification through polymerase chain reaction (PCR) and histopathologic studies, to find out the status of the disease. The results allowed asserting the infection by the presence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAsP) in positive variable rates. The ELISA technique showed high capacity in identification of the sub clinical affected animal, which proved its potential as a diagnostic primary test in the establishment of future control programs. The PCR amplification revealed Mycobacterium avium subspecie genome presence, which lead to predict these animals infection by MAsP, in spice of the impossibility to accomplish clear clinical, clinic pathologic, microbiologic and histopathologic evidences that allowed corroborating the diagnosis. The narrow relation between ELISA and PCR results ratified not only the diagnostic confirmation, but also they validated the data collected through the serological test.