DDRT-PCR approaches applied for preeminent results in the isolation of DETs from fish brain tissues / Aplicação de abordagens de DDRT-PCR para aprimoramento de resultados no isolamento de DETs a partir de tecido cerebral de peixes

Differential Display (DD) is a technique widely used in studies of differential expression. Most of these analyses, especially those involving fish species, are restricted to species from North America and Europe or to commercial species, as salmonids. Studies related to South American fish species are underexplored. Thus, the present work aimed to describe DD technique modifications in order to improve outcomes related to the isolation of DETs (Differentially Expressed Transcripts), using Leporinus macrocephalus, a large commercially exploited South American species, as a fish design. Different DDRT-PCR approaches were applied to brain samples and the products of the reactions were analyzed on 6% polyacrylamide gels stained with 0.17% Silver Nitrate (AgNO3). The use of PCR reactions under high stringency conditions and longer oligonucleotides based on VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) core sequences led to better results when compared to low stringency PCR conditions and the use of decamer oligonucleotides. The improved approach led to the isolation of differentially expressed transcripts on adult males and females of L. macrocephalus. This study indicates that some modifications on the DDRT-PCR method can ensure isolation of DETs from different fish tissues and the development of robust data related to this approach.

Display Diferencial (DD) é uma técnica amplamente utilizada em estudos de expressão diferencial. A maioria desses estudos envolvendo espécies de peixes está restrita a espécies da América do Norte e Europa ou a espécies comerciais, como os salmoniformes. Estudos relacionados a peixes da América do Sul são ainda pouco explorados. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo descrever modificações na técnica de DD, a fim de melhorar os resultados relacionados ao isolamento de DETs (Transcritos Diferencialmente Expressos), utilizando Leporinus macrocephalus, peixe explorado comercialmente na América do Sul, como espécie para tal delineamento. Diferentes abordagens de DDRT-PCR foram desenvolvidas a partir de amostras de tecido cerebral e os produtos das reações foram analisados em gel de poliacrilamida 6% corados com 0,17% de nitrato de Prata (AgNO3). A utilização de reações de PCR sob condições de elevada estringência e oligonucleotídeos mais longos, com base em sequências cerne de VNTR (Número Variável de Repetições em Tandem), mostrou melhores resultados quando comparada a condições de baixa estringência e ao uso de oligonucleotídeos decâmeros. A estratégia empregada permitiu o isolamento de transcritos diferencialmente expressos em machos e fêmeas adultos de L. macrocephalus. Este estudo evidencia que modificações no método de DDRT-PCR garantem o melhor isolamento de DETs a partir de diferentes tecidos de peixes e asseguram a obtenção de dados mais sólidos relacionados a essa abordagem.

Avaliação da toxicidade do cobre para o piauçu ( Leporinus macrocephalus, Garavello & Britski, 1988 ) por meio de parâmetros leucocitários e enzimáticos / Evaluation of the toxicity of copper for piauçu ( Leporinus macrocephalus ) through leukocyte and enzymatic parameters

Como forma de monitoramento de áreas degradadas, testes de toxicidade têm sido amplamente utilizados. Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do cobre para o piauçu a partir da determinação da CL50 96h e da análise de alterações nos padrões enzimáticos e leucocitários, em exposição subletal (25 e 50% da concentração letal) por 96h. A CL50 96h do cobre para o piauçu foi 0,09 ± 0,03 mg L-1. Após a exposição às concentrações subletal, os valores das concentrações enzimáticas de Alanina Aminotrasferase e Aspartato Aminotransferase não apresentaram diferença significativa entre os indivíduos do grupo-controle e dos expostos ao metal. A glicose plasmática apresentou aumento significativo nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50, quando comparados ao controle. O eosinófilo, o linfócito e o neutrófilo não apresentaram diferença significativa do grupo-controle. Os trombócitos aumentaram significativamente nos peixes expostos a 50% da CL50; os monócitos, nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50. Os resultados indicam que o piauçu é uma espécie sensível aos efeitos letais do cobre e que a exposição a concentrações subletais causa um distúrbio imunológico, porém não induz dano hepático, de acordo com as enzimas mensuradas.

Toxicity tests have been widely used as a form of monitoring degraded areas. This work has as objective to evaluate the toxicity of copper for Piauçu from the determination of LC50 for 96 hours and analysis of alterations in the enzymatic and leukocyte patterns, in sublethal exposure (25 and 50% of the lethal concentration) for 96 hours. The LC50 of copper for Piauçu, during 96 hours, is 0.09±0.03 mg L-1 Cu2+. After exposure to the sublethal concentrations, enzymatic concentrations of Alanine Aminotrasferase and Aspartate Aminotransferase did not show any significant difference between the individuals of the control and metal groups. Plasma glucose showed a significant increase in fish exposed to 25 and 50% of LC50, when compared with control. Eosinophil, lymphocyte and neutrophil showed no significant difference from the control group. Thrombocytes increased significantly in the fish exposed to 50% of the LC50, as did monocytes in fish exposed to 25 and 50% of LC50. The results indicate that Piauçu is a species sensitive to the lethal effects of copper, and that exposure to the sublethal concentrations causes immune disorder; however, it does not induce liver damage according with the measured enzymes.

Estudo morfológico do tecido hepático de Leporinus macrocephalus / Morphological study of the hepatic tissue of Leporinus macrocephalus

O presente trabalho objetivou análise macroscópica e histológica do fígado de Leporinus macrocephalus para avaliar a estrutura do tecido hepático. Os peixes provenientes de um pesqueiro da região de Bauru, Estado de São Paulo, foram anestesiados, mortos, e os fígados foram retirados e encaminhados ? rotina histológica, com inclusão em paraplast. A macroscopia mostrou um figado de estrutura homogênea, de coloração marron-avermelhada, localizado na região medial do corpo, caudalmente ao coração e posterior ás brânquias, apresentando três lóbos de forma piramidal, sendo um central e dois laterais direito e esquerdo. A análise histológica revelou o tecido hepático constituído por cordões duplos de hepatócitos circundados por sinusóides, denominado de 'muralha dupla'. Revelou, ainda, um sistema biliar disperso pelo parênquima hepático mostrando ductos com epitélio cúbico simples, circundado por fibras musculares e tecido conjuntivo. Células do tecido pancreático exócrino foram observadas, margeando vasos sangüíneos, organizando-se em ácinos apresentando grânulos de zimogênio. Além disso, existem centros melanomacrófagos distribuídos ao longo de todo parênquima, preferencialmente próximos aos vasos sanguíneos, formados por células que acumulam materiais como melanina e lipofucsina, podendo sua presença estar relacionada com o estado nutricional do peixe.

The objective of this work was to analyze the liver of Leporinus macrocephalus at the macroscopic and histologic level by evaluating the characteristics of the hepatic tissue. The fishes from a fishery in Bauru, S.P., were collected and sacrificed by destroying the spinal cord; afterwards the collected hepatic tissue was fixed and followed by histological routine. Macroscopic analysis of L. macrocephalus liver showed an organ of homogeneous structure, with red-brown color, located in the medial region of the body, caudal to heart and after the gills. It showed 3 pyramidal lobes, one central and two lateral right and left. The histological analysis showed the hepatic tissue constituted by hepatocytes cords surrounded by sinusoids, named 'muralium duplex'. It yet revealed the diffused, distribution bile system by hepatic parenchyma, showing ducts with simple cubic epithelium, surrounded by muscular fibres and connective tissue. Cells of the exocrine pancreatic tissue were observed surrounding blood vessels in acinar arrangement as zymogen granules. Furthermore, there are melanomacrophages centers distributed along the hepatic parenchyma, preferably next to the blood vessels, constituted by cells accumulating material, such as melanin and lipofucsin, whose presence may be related to the nutritional status of the fish.