Antiangiogenic activity of photobiomodulation in experimental model using chorioallantoic embryonic membrane of chicken eggs / Atividade antiangiogênica da fotobiomodulação em modelo experimental usando membrana embrionária corioalantóide de ovos de galinhas

ABSTRACT Purpose: The purpose of this study was to investigate the vascular effects of photobiomodulation using a light-emitting diode on the chorioallantoic embryonic membrane of chicken eggs grouped into different times of exposure and to detect the morphological changes induced by the light on the vascular network architecture using quantitative metrics. Methods: We used a phototherapy device with light-emitting diode (670 nm wavelength) as the source of photobiomodulation. We applied the red light at a distance of 2.5 cm to the surface of the chorioallantoic embryonic membrane of chicken eggs in 2, 4, or 8 sessions for 90 s and analyzed the vascular network architecture using AngioTool software (National Cancer Institute, USA). We treated the negative control group with 50 μl phosphate-buffered-saline (pH 7.4) and the positive control group (Beva) with 50 μl bevacizumab solution (Avastin, Produtos Roche Químicos e Farmacêuticos, S.A., Brazil). Results: We found a decrease in total vessel length in the Beva group (24.96% ± 12.85%) and in all the groups that received 670 nm red light therapy (2× group, 34.66% ± 8.66%; 4× group, 42.42% ± 5.26%; 8× group, 38.48% ± 6.96%), compared with the negative control group. The fluence of 5.4 J/cm2 in 4 sessions (4×) showed more regular vessels. The number of junctions in the groups that received a higher incidence of 670 nm red light (4× and 8×) significantly decreased (p<0.0001). Conclusion: Photo-biomodulation helps reduce vascularization in chorioallantoic embryonic membrane of chicken eggs and changes in the network architecture. Our results open the possibility of future clinical studies on using this therapy in patients with retinal diseases with neovascular components, especially age-related macular degeneration.

RESUMO Objetivo: investigar os efeitos vasculares da foto-biomodulação com diodo emissor de luz utilizando membrana embrionária corioalantóide de ovos de galinhas em grupos com diferentes tempos de exposição e detectar as alterações morfológicas por meio de métricas quantitativas promovidas pela luz na arquitetura da rede vascular. Métodos: Um aparelho de fototerapia com diodo emissor de luz no comprimento de onda de 670 nm foi usado como fonte de fotobiomodulação. A luz vermelha foi aplicada a uma distância de 2,5 cm da superfície da membrana embrionária corioalantóide em 2, 4 ou 8 sessões de 90 s a arquitetura da rede vascular foi analisada por meio do software AngioTool (National Cancer Institute, USA). Usamos um grupo controle negativo tratado com 50 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e um grupo controle positivo (Beva) tratado com 50 µL de solução de bevacizumabe (Avastin, Produtos Roche Químicos e Farmacêuticos S.A., Brasil). Resultados: Uma diminuição no comprimento total do vaso foi detectada para o grupo Beva (24,96 ± 12,85%), e para todos os grupos que receberam terapia de luz vermelha de 670 nm, 34,66 ± 8,66% (2x), 42,42 ± 5,26% (4x) e 38,48 ± 6,96% (8x) em comparação ao grupo controle. A incidência de 5,4 J/cm2 em 4 sessões (4x) mostrou vasos mais regulares. A redução foi mais intensa nos grupos que receberam maior incidência de luz vermelha de 670 nm (4x e 8x). Conclusão: A fotobiomodulação contribui para a redução da vascularização nos vasos da membrana embrionária corioalantóide de ovos de galinhas e mudanças na arquitetura da rede. Os achados deste experimento abrem a possibilidade de considerar um estudo clínico usando esta terapia em pacientes com doenças retinais com componentes neovasculares, especialmente degeneração macular relacionada à idade.

Avaliação preliminar dos efeitos da lidocaína sobre a membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) / Preliminary analysis of chorioallantoic membrane of chick embryo (CAM) toxicity induced by lidocaine

Esse estudo avaliou os efeitos da Lidocaína (anestésico local) sobre a membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM). Os modelos experimentais mais utilizados para avaliação de substâncias químicas necessitam de um longo tempo de experimentação, alto custo e inúmeras implicações éticas. Muitos autores consideram a CAM viável, pois minimiza a dor e o sofrimento das cobaias além de apresentar respostas teciduais semelhantes àquelas observadas em mamíferos, com a vantagem da exclusão de procedimentos cirúrgicos e visualização constante do sítio de implante. Objetivo: Avaliar a resposta da CAM frente à lidocaína e verificar os efeitos sobre os embriões. Método: O anestésico foi aplicado (0,5; 1; 2; 5 e 10 μg / ml) através de uma abertura feita na casca, sobre gel fisiológico (0,5 ml) posicionado sobre a CAM de ovos com seis dias de incubação. Após sete dias os ovos foram reabertos, observados com microscópio estereoscópico e fotografados em nível macroscópico. Após, avaliamos o número de vasos da membrana através da sobreposição digital de uma grade nas fotografias. As membranas foram retiradas e coradas (H&E e Tricrômico de Masson) para a análise histológica. Resultados: a Lidocaína não provocou efeitos sobre o número de vasos na CAM, mas as observações macroscópicas e microscópicas demonstraram a presença de colágeno. Também foi observada má formação da parede ventral, do bico, das asas e dos dedos dos embriões. Conclusão: Preliminarmente, de acordo com esse protocolo experimental a Lidocaína não teve efeitos pró- ou antiangiogênicos, mas parece provocar distúrbios no processo de reparação tecidual, além de desencadear alterações morfológicas nos embriões...

The goal of this study was to evaluate the response of the chorioallantoic membrane of chick embryo (CAM) to Lidocaine (local anesthetic) and observe its effect on the embryo. Some authors has considered the experimental model of CAM viable, because their tissue responses similar to those observed in mammals. Methods: For the assays (n=8), the eggs were cleaned and a window was opened in the eggshell for access to CAM. All eggs were kept in a humidified incubator at 37°C and gently agitated manually twice a day. The implants with the Lidocaine (0.5, 1, 2, 5 and 10 μg / ml) were performed on gel saline (0.5 ml) previously positioned on the CAM of fertile eggs with six days of incubation. After seven days the eggs were reopened to the observation on stereoscopic microscope. The samples were photographed and later, removed for subsequent processing and histological analysis (HE and Masson trichrome). We also evaluated the number of blood vessels and pro- or antiangiogenic response of CAM. The counting was made using a software (Image- Pro Plus version 4.5™). Results: Lidocaine had no pro- or antiangiogenic effects on CAM. The histological slides have shown collagen fibers as possible injury and/or reparation signals. The chick embryo under lidocaine effects has suffered malformation of ventral wall, malformation of jaw, as well as morphological changes of the fingers and wings. Conclusion: According to our experimental protocol, Lidocaine had no effects on the number of vessels on the CAM, but the histological analysis showed disturb on reparation process. The chick embryos under drug effects were modified at different body structures. The results reported in this study (potentially caused by the anesthetic agent) provide additional perspectives to better understand the mechanisms triggered by Lidocaine...

Avaliação morfológica das membranas fetais e da placenta de Mazama gouazoubira (veado-catingueiro) de vida livre no terço inicial da gestação / Morphological evaluation of fetal membranes and placenta of wild life Mazama gouazoubira deer in the first third of pregnancy

Mazama gouazoubira, o veado-catingueiro, é uma espécie de cervídeo de porte pequeno, que pode ser encontrado na América do Sul, desde o sul do Uruguai até o norte de Mato Grosso, no Brasil. Este estudo teve como objetivo descrever as membranas fetais e a placenta de M. gouazoubira no terço inicial de gestação. As amostras coletadas foram analisadas macroscopicamente e microscopicamente. O exame do útero demonstrou uma gestação univitelina e um embrião com crown-rump de 13mm. Na análise do embrião pode ser observado o olho pigmentado, as saliências auriculares, o mesonefro e e metanefro em desenvolvimento, o fígado e sua proeminência externa, o estômago, os membros torácicos e os brotos dos membros pélvicos. A placenta apresentou-se oligocotiledonária e no útero puderam ser observadas nove carúnculas. O saco gestacional mediu 15cm de comprimento e, como observado no início da gestação dos ruminantes domésticos, os cotilédones não puderam ser identificados macroscopicamente. Uma fraca adesão foi observada entre as carúnculas e a membrana corioalantóica (cotilédones) que formavam os placentônios. A membrana corioalantóica demonstrou um alantóide bem vascularizado composto por uma fina camada de células de núcleos e citoplasmas alongados. Na outra face da membrana, o cório foi composto por células cúbicas, de citoplasmas escassos e núcleos grandes e arredondados, características de células trofoblásticas. Envolvendo o embrião visualizou-se o saco amniótico constituído de duas camadas passíveis de separação mecânica, que apresentaram morfologia similar, sendo formadas por um epitélio pavimentoso avascular. Não foi observado saco vitelino no estágio gestacional do espécime estudado. Conclui-se que a placenta de M. gouazoubira é oligocotiledonária, como observado em outros cervídeos, e que as membranas fetais apresentam semelhanças com a de outros ruminantes, incluindo as características citológicas. Estudos adicionais são necessários para determinar a presença do saco vitelino e quando ocorre sua regressão.

Mazama gouazoubira is a small-sized deer, which can be found in South America, from southern Uruguay to the north of Mato Grosso, Brazil. This study aimed to describe the fetal membranes and placenta of M. gouazoubira in the first third of pregnancy. Samples collected were macroscopically and microscopically analyzed. Uterus examination demonstrated univitelinic gestation with an embryo measuring a crown-rump length of 13mm. In the embryo analysis we could identify the pigmented eye, auricular hillocks, mesonephron and early metanephron, liver and its external prominence, stomach, thoracic members and buds of pelvic members. Placenta was oligocotyledonary and nine caruncles were found in the uterus. Gestational sac measured 15cm in length, and, as observed in the early gestation of domestic ruminants, cotyledons could not be identified macroscopically. A weak adhesion was found between caruncles and chorioallantoic membrane (cotyledons) forming the placentomes. The chorioallantoic membrane showed a well-vascularized allantoid composed by a thin layer of cells with stretched nucleus and cytoplasm. On the other side of the membrane, the chorion was composed by cubic cells with scant cytoplasm and large-rounded nuclei, features of trophoblast cells. Involving the embryo we identified a two-layered amniotic sac. Layers could be mechanically separated and had similar morphology, showing a non-vascularized squamous epithelium. There was no yolk sac in the gestational stage of this specimen. We concluded that the placenta of M. gouazoubira is an oligocotyledonary placenta, as observed in others cervids, and that the fetal membranes showed similarities with those from other domestic ruminants, including cytological characteristics. Further studies are required in order to determine the presence of the yolk sac and its regression time.