ABSTRACT
A guanitoxina (GNT) é uma neurotoxina produzida por algumas cepas de cianobactérias dos gêneros Dolichospermum e Sphaerospermopsis>. A GNT é o único organofosforado natural, capaz de causar a morte de animais selvagens e domésticos devido à inibição irreversível da acetilcolinesterase. Apesar de sua alta toxicidade, o diagnóstico da GNT em amostras biológicas ainda é um grande desafio. A dificuldade para sua detecção está diretamente ligada à sua instabilidade em altas temperaturas e pH alcalino, tornando difícil seu monitoramento em corpos d'água. Por isso, esta pesquisa objetivou estudar a estabilidade e biodisponibilidade da GNT em amostras aquosas, com intuito de obter mais informações sobre a natureza química e biológica dessa potente neurotoxina. Para realizar este estudo, a cepa ITEP-24 (S. torques-reginae) produtora de GNT foi cultivada em laboratório sob condições controladas, para obter biomassa para os experimentos de extração, semi-isolamento, estabilidade, ensaio in vitro e identificação por LC-MS/MS. Primeiramente foram realizados testes de extração da GNT partir de células liofilizadas da cepa ITEP-24 utilizando água, metanol e etanol em pH ácido. Depois utilizou-se dois métodos de extração em fase sólida (SPE) com cartuchos preenchidos com fases estacionarias C18 em fase reversa e sílica gel em fase normal, com objetivo de avaliar qual método de SPE seria melhor para extrair e concentrar a GNT. Nós também testamos métodos para lisar as células com sondas de ultrassom, misturador e centrifugação. Além dos métodos de extração, nós avaliamos a estabilidade da toxina em diferentes temperaturas, para isso a biomassa seca contendo a GNT ficou condicionada a 4 °C, 23 °C, -20 °C, -80 °C durantes seis meses, e análises de identificação foram realizadas dentro período de 150 dias em uma sequência de 30 dias. A estabilidade da toxina foi analisada também a partir de extrações em soluções com diferentes valores de pH (1,5; 3,0; 5,0; 7,0; 8,5; 10,5) e temperatura (23 ºC e 37 ºC). Depois, analisou-se a biodisponibilidade da GNT em células frescas da linhagem ITEP-24 através de teste de dissolução in vitro. O objetivo deste teste foi avaliar a liberação da toxina intracelular em meio simulado do conteúdo gástrica e intestinal com e sem enzimas digestivas para compreender e estimar a disponibilidade da GNT in vivo. Os resultados de todos experimentos descritos neste estudo, foram obtidos a partir de análises por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) acoplado ao espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo LC-QqQ-MS/MS utilizando as transições 253>58, 253>159 e 159>58 [M+H]+ utilizando coluna com fase estacionária zwitteriônica (ZIC). A identificação da GNT foi realizada também por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas de alta resolução (LC-HR-QTOF-MS) com coluna Luna C18, Hydro-RP C18 e ZIC-HILIC. Dos protocolos de extração testados, a combinação de metanol/água (70:30 v/v) com ácido acético (0.3%) extraiu maior quantidade relativa da GNT a partir de células frescas e liofilizadas da cepa ITEP-24 e a concentração da toxina foi maior em amostras de células frescas. Em relação aos métodos de lise celular, as extrações realizadas em sonda de ultrassom com banho-maria e centrifugação por 1h foram estatisticamente significantes para liberar a toxina intracelular. Não houve diferença significativa entre os testes de SPE, no entanto, a semipurificação da toxina foi melhor com cartucho preenchido com sílica gel em fase normal e adaptação desse método em coluna aberta permitiu obter uma fração enriquecida com GNT. A GNT mostrou ser mais estável em pH ácido, sendo o pH 3,0 o melhor para manter e extrair a toxina em amostras aquosas e a toxina intracelular presente em células secas podem degradar em temperatura de 23 °C por um período de 150 dias mesmo em solução com pH 3,0. Durante os testes de extração e purificação foi observado também a degradação da toxina em processos de secagem e ressuspensão. As análises realizadas no LC-HR-QTOF-MS com diferentes métodos cromatográficos possibilitou a identificação da GNT, porém o método realizado com coluna ZIC-HILIC mostrou melhor resolução cromatográfica dos picos relativos m/z e tempo de retenção de toxina. Os resultados obtidos nos testes de dissolução in vitro mostraram que a GNT fica mais disponível no simulado gástrico com e sem a enzima pepsina, mas também pode ser absorvida no intestino. Portanto, o teste de dissolução in vitro pode ser uma ferramenta útil para a avaliação de risco de cianotoxinas in vivo, devido ao seu potencial de monitorar qualitativa e quantitativamente substâncias dissolvidas em fluidos gastrointestinais. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações valiosas para uma melhor compreensão da estabilidade e biodisponibilidade do GNT. Além disso, os métodos apresentados neste estudo podem ser úteis para diversas aplicações projetadas para identificar a toxina em amostras ambientais, bem como orientações para procedimentos de purificação da GNT
Guanitoxin (GNT) is a neurotoxin produced by some strains of cyanobacteria of the genus Dolichospermum and Sphaerospermopsis. GNT is the only natural organophosphate, capable of causing the death of animals from wild and domestic animals due to irreversible inhibition of acetylcholinesterase. Despite its high toxicity, the diagnosis of GNT in biological samples is still a significant challenge. The difficulty in its detection is directly linked to its instability at high temperatures and alkaline pH, making it difficult to monitor in bodies of water. Therefore, this research aimed to study the stability and bioavailability of GNT in aqueous samples to provide more information about the chemical and biological nature of this molecule. The strain ITEP-24 (S. torques-reginae) producing GNT was grown in the laboratory under controlled conditions to obtain biomass for the extraction, semi-isolation, stability, in vitro tests, and toxin identification by LC-MS/MS. Firstly, tests were carried out to extract GNT from lyophilized cells strain ITEP-24 using water, methanol, and ethanol at acidic pH and, two SPE methods in cartridges with stationary phases of C18 reverse phase and normal phase gel silica, to evaluate which would be better to extract and concentrate the GNT. We also tested different methods of cell lysis, such as ultrasound probes, mixers, and centrifugation. In addition to the extraction methods, the stability of the toxin was evaluated at different temperatures, for this, the dry biomass containing the toxin was conditioned at 4 °C, 23 °C, -20 °C, -80 °C for 150 days and analysis of the identification of the GNT was carried out within that period in a sequence of 30 days. The toxin stability was also analyzed from extractions in solutions with different pH values (1.5; 3.0; 5.0; 7.0; 8.5; 10.5) and temperature (23 ºC and 37 ºC). In addition, we performed dissolution tests with fresh cells of the ITEP-24 strain to evaluate the bioavailability of GNT in simulated gastric and intestinal fluids with and without digestive enzymes to understand and estimate the availability of GNT in vivo. The results of all experiments described in this study were obtained from analyzes by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled to the LC-QqQ-MS/MS triple quadrupole mass spectrometer using the transitions m/z 253> 58, m/z 253> 159 and m/z 159> 58 [M + H]+ using a column with the zwitterionic stationary phase (ZIC). Liquid chromatography coupled to the high-resolution mass spectrometer (LC-HR-QTOF-MS) with Luna column C18, Hydro-RP C18, and ZIC-HILIC carried out the identification of the GNT. From the extraction protocols tested, the combination of methanol/water (70:30 v/v) with acetic acid (0.3%) extracted a greater relative amount of GNT from fresh and lyophilized ITEP-24 cells, and the concentration of the toxin is higher previously fresh. Concerning cellular methods, the ultrasound probe with a water bath and centrifugation for 1h ware statistically significant to release the intracellular toxin. There was no significant difference between the SPE tests. However, the semi-purification of the toxin was better with a cartridge filled with gel silica in the normal phase and adaptation of this method in an open column allowed to obtain a fraction enriched with GNT. GNT was more stable at acid pH, with pH 3.0 being the best to maintain and the intracellular toxin present in dry cells can degrade at a temperature at 23 °C for 150 days even in pH 3.0 solution. The toxin can also hydrolyze in the drying and resuspension processes. The analyzes carried out in LC-HR-QTOF-MS with different chromatographic methods made it possible to identify the GNT itself, however, the ZIC-HILIC column method showed excellent chromatographic resolution of the relative m/z peaks and toxin retention time. The results obtained in the in vitro dissolution tests showed that GNT is more available in the gastric simulation with and without the enzyme pepsin, but it can also be absorbed in the intestine. Thus, in vitro dissolution tests can be used as a useful tool for the risk assessment of cyanotoxins in vivo due to their potential to qualitatively and quantitatively monitor substances dissolved in gastrointestinal fluids. The results presented in this study provide valuable information for a better understanding of the stability and bioavailability of GNT. Besides, the methods presented in this study can be useful for various applications designed to identify the toxin in environmental samples, as well as guidance on procedures for purifying GNT