ABSTRACT
Resumen: La concha negra Anadara tuberculosa es una especie emblemática del ecosistema manglar que está actualmente en condición vulnerable. El desarrollo de su acuicultura requiere identificar biomarcadores moleculares, en particular asociados al estrés por salinidad en mira al inicio de programas de mejoramiento genético. Se recolectaron ejemplares de Anadara tuberculosa del manglar colindante a la Bahía de Puerto Pizarro (Tumbes, Perú) entre enero 2015 y febrero 2016. Estos individuos fueron sometidos a condiciones de estrés hipo-osmótico (extremo: 5 y 10 ppt); (moderado: 15 y 25 ppt) y sin estrés (grupo control: 33 ppt) por 16 días después de haber sido separados en grupos de diez animales y por triplicado. La presencia de biomarcadores del estrés por salinidad fue evaluada a nivel genético con la detección por PCR de 19 genes reportados como actores claves de la osmorregulación en bivalvos como ostras y mejillones y a nivel proteomico con la secuenciación de péptidos expresados en tejidos de animales expuestos a diferentes salinidades por espectrometría de doble masa. Ninguno de los marcadores genéticos probados pudo ser amplificado por PCR lo que sugiere que A. tuberculosa presente diferencias genéticas significativas en comparación con otros moluscos. El análisis proteómico realizado por MALDI TOF/TOF a nivel de tejido branquial de A. tuberculosa permitió identificar 26 péptidos expresados de formas presenciales y diferenciales a las diferentes salinidades evaluadas, resaltando posibles marcadores como la HSP70 y una proteína transmembrana de transporte de cloruro que están relacionadas con la adaptación a la salinidad. Estas secuencias aminoacídicas permitirán diseñar iniciadores nucleotidicos específicos a A. tuberculosa para la puesta en marcha de futuras investigaciones en ecofisiología de este importante recurso.
Abstract: The pustulose ark A. tuberculosa is an emblematic species of mangrove ecosystem that is currently in a vulnerable condition. The development of its aquaculture, to begin with genetic breeding programs, requires the identification of molecular biomarkers, particularly those associated with salinity stress. With this purpose, specimens of A. tuberculosa were collected from the adjacent mangroves of Puerto Pizarro bay (Tumbes, Perú), from January 2015 to February 2016. Different assays (groups of ten animals in triplicate) were undertaken in separated periods of 16 days: hypo-osmotic stress (extreme: 5, 10 ppt); (Moderate: 15, 25 ppt) and no stress (control group: 33 ppt). The presence of salinity stress biomarkers was assessed at the genetic level throughout PCR detection of 19 genes reported to be key actors in osmoregulation, and at the proteomic level with the sequencing of peptides (tandem mass spectrometry MALDI TOF/TOF), expressed in ark tissues exposed to different salinities. None of the tested genetic markers could be amplified by PCR, suggesting that A. tuberculosa has significant genetic differences compared to other mollusks. Proteomic analysis by mass spectrometry on A. tuberculosa gill tissue, allowed to identify 26 peptides expressed in presential and differential forms at different salinities, highlighting possible markers such as HSP70 and trans-membrane chloride channel transportation protein, to be related with salinity adaptation. These amino acid sequences will allow the design of target specific primers for A. tuberculosa, to implement future research in ecophysiology of this important fishery resource. Rev. Biol. Trop. 65 (3): 1142-1151. Epub 2017 September 01.
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la Enfermedad de Chagas, una entidad endémica no controlada y en crecimiento en Latinoamérica. El parásito, durante su ciclo de vida, se ve sometido a cambios bruscos en la osmolaridad. Tales situaciones de estrés osmótico ameritan sistemas fisiológicos que le permitan a estas células adaptarse y sovrevivir a la nueva situación. En distintos organismos, no de los elementos primordiales que intervienen en osmorregulación son las acuaporinas, proteínas de membrana pertenecientes a la familia MIP ("major intrinsec protein"), que permiten el paso selectivo de agua (acuaparinas clásicas) y otras moléculas no cargadas (acuagliceroporinas) a través de membranas biológicas, en función de gradientes osmóticos. En el genoma de T. cruzi existen cinco genes que presentan similitud con proteínas de la familia MIP. Una de estás ya ha sido caracterizada, TcAQP1 (Trypanosoma cruzi, acuaporina 1), un canal permeable solo al agua. En este artículo de investigación se inició el estudio de un segundo gen con similitud a acuaporina, al cual hemos denominado TcAQP2. El gen TcAQP2 codifica para una proteína de 276 aminoácios. Por medio de herramientas de bioinformática se realizó la predicción de las estructura de dicha proteína; posee características que permiten ubicarla dentro de la familia MIP. Se realizó el clonamiento y secuenciación de la TcAQP2, detectándose diez mutaciones silentes. Este hecho sugiere que se trata de mutaciones propias de la cepa de T. cruzi CL Brener utilizada en el desarrollo experimental de este trabajo. Posteriormente se realizó el subclonamiento de TcAQP2 en el plásmido de expresión en el modelo de levadura pYES.2 y se transformó en las células de saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional de la TcAQP2 en dichas células, muestra evidencias de que está proteína interviene en osmorregulación cuando las células son expuestas a choques hiper-osmóticos e hipo-osmóticos...
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of changes disease, es prevalent throughout Latin America. During its life cycle, the parasite undergoes extreme fluctuations in osmolarity, consequentrly physiological systems are required to assure its survival. In many organisms one of the more important systems involved in osmoregulation are aquaporins. These proteins are members of the major intrinsic protein family (MIP). Aquaporins can be divided in two groups according to its permeablity: the first one is only permeable to water (orthodox aquiaporins and the second one is permeable to water, glycerol, and other small, uncharged molecules (aquaglyceroporins). In the T cruzi genome there are 5 genes that encode proteins similar to aquaporins. One of these genes (Trypanosoma cruzi aquaporin 1, TcAQp1) has been already characerized as a channel that is only permeable to water. It was also demonstrated that TcAQP1 is involved in parasite osmoregulation. In this work, we started to investigate other gene with aquaporin similarity, which we named Trypanosoma cruzi aquaporin 2 (TcAQP2). The gene TcAQP2 encodes a protein of 276 aminoacids. The protein has six putative transmembrane domains and the two signature motifs asparagine-proline-alanine (NPA), which is the classical conserve motif in the MIP family proteins. Cloning and sequencing of the TcAQP2 gene allowed the detection of ten silent mutations in all clones analyzed, as compare to the sequence reported in data bank of the parasite, suggesting that they belong to the CL Brener strain used in this study. In order to analyze the TcAQP2 function, subcloning in the plasmid for heterologous expression in yeast (pYES.2) of this gene was performed. After transformation and functional expression alf TcAQP2 in Saccharomyces cerevisiae, cells were exposed to osmotic stress. The results indicate that this protein is involved in osmoregulation, and suggest that TcAQP2 participate as a channer for water and/or glycerol in...