Síntesis en fase sólida de un neuropéptido cosmecéutico y su microencapsulación en un sistema liposomal / Solid phase synthesis of a cosmeceutical neuropeptide and its microencapsulation in a liposomal system / Síntese de fase sólida de um neuropeptídeo cosmecêutico e sua microencapsulação em um sistema lipossomal

RESUMEN Introducción: Actualmente los péptidos sintéticos se han constituido en una novedosa alternativa para el tratamiento de la piel envejecida. Acetilhexapéptido-3 (Ac-EEMQRR-NH2) ha sido utilizado para inducir reducción de líneas de expresión de manera análoga a la toxina botulínica, pero sin efectos tóxicos. Objetivo: Sintetizar el acetilhexapéptido-3 y desarrollar un sistema liposomal para su encapsulación y favorecer su paso a través de una membrana modelo. Metodología: El péptido fue obtenido mediante síntesis en fase sólida (SFS) empleando la estrategia Fmoc/tBu, fue purificado y plenamente caracterizado. El sistema liposomal con acetilhexapéptido-3 encapsulado fue desarrollado mediante la formación de una emulsión con posterior inversión de fase por evaporación del solvente orgánico. Los sistemas fueron caracterizados en su tamaño, potencial zeta, eficiencia de encapsulación del neuropéptido y de manera preliminar se realizó un estudio de permeabilidad ex vivo. Resultados: Es posible sintetizar péptidos cortos con alto grado de pureza y buen rendimiento, utilizando la metodología de SFS Fmoc/tBu. De acuerdo con la caracterización, el sistema liposomal adelantado sugiere una buena estrategia para la encapsulación del acetilhexapéptido-3 y su potencial aplicación en el desarrollo un novedoso producto cosmecéutico.

SUMMARY Introduction: Currently synthetic peptides have become a novel alternative for the treatment of aging skin. Acetylhexapeptide-3 (Ac-EEMQRR-NH2) has been used to induce reduction of expression lines in a manner analogous to botulinum toxin, but without toxic effects. Aim: To synthesize acetylhexapeptide-3 and to develop a lipo-somal system for its encapsulation and favor its passage through a model membrane. Methodology: The peptide was obtained by solid phase synthesis (SFS) using the Fmoc / tBu strategy, it was purified and fully characterized. The liposomal system with encapsulated acetylhexapeptide-3 was developed by forming an emulsion with subsequent phase inversion by evaporation of the organic solvent. The systems were characterized in their size, zeta potential, neuropeptide encapsulation efficiency and a preliminary ex vivo permeability study was carried out. Results: It is possible to synthesize short peptides with a high degree of purity and good yield, using the SFS Fmoc / tBu methodology. According to the characterization, the advanced liposomal system suggests a good strategy for the encapsulation of acetylhexapeptide-3 and its potential application in the development of a novel cosmeceutical product.

RESUMO Introdução: Atualmente os peptídeos sintéticos têm se tornado uma nova alternativa para o tratamento do envelhecimento cutâneo. O acetilhexapeptídeo-3 (Ac-EEMQR-R-NH2) tem sido usado para induzir a redução das linhas de expressão de maneira análoga à toxina botulínica, mas sem efeitos tóxicos. Objetivo: Sintetizar acetilhe-xapeptídeo-3 e desenvolver um sistema lipossomal para seu encapsulamento e favorecer sua passagem por uma membrana modelo. Metodologia: O peptídeo foi obtido por síntese em fase sólida (SFS) utilizando a estratégia Fmoc / tBu, foi purificado e totalmente caracterizado. O sistema lipossomal com acetilhexapeptídeo-3 encapsulado foi desenvolvido pela formação de uma emulsão com subsequente inversão de fase por evaporação do solvente orgânico. Os sistemas foram caracterizados quanto ao tamanho, potencial zeta, eficiência de encapsulação de neuropeptídeos e um estudo preliminar de permeabilidade ex vivo foi realizado. Resultados: É possível sintetizar peptídeos curtos com alto grau de pureza e bom rendimento, utilizando a metodologia SFS Fmoc / tBu. De acordo com a caracterização, o sistema lipossomal avançado sugere uma boa estratégia para a encapsulação do acetilhexapeptídeo-3 e seu potencial aplicação no desenvolvimento de um novo produto cosmecêutico.

Evaluación y uso de un péptido sintético para la detección de anticuerpos específicos contra Plasmodium falciparum / Development and use of a synthetic peptide for the detection of specific antibodies against Plasmodium falciparum

Resumen Introducción. La malaria continúa siendo una de las enfermedades que causa mayor morbi-mortalidad a nivel mundial. Por esta razón es importante desarrollar herramientas diagnósticas eficaces que se implementen como estrategias para el control de la enfermedad. Objetivos. Estandarizar las condiciones del inmunoensayo enzimático (ELISA), para la detección de IgG específica contra Plasmodium falciparum en sueros de pacientes diagnosticados por gota gruesa con malaria no complicada por P. falciparum, empleando como antígeno un extracto proteico obtenido a partir de cultivo de P. falciparum o un péptido sintético derivado de la proteína de superficie de merozoito GLURP (del inglés: glutamate rich protein). Materiales y métodos. Para la estandarización de la técnica, se utilizaron 22 sueros de pacientes positivos para malaria por P. falciparum y 11 diagnosticados positivos para malaria por P. vivax utilizando la técnica de gota gruesa. Como controles negativos se utilizaron 44 sueros de individuos sanos. Los sueros fueron probados contra extracto de proteínas del parásito y el péptido sintético IMT 94 derivado de la proteína GLURP, para evaluar las concentraciones y las diluciones óptimas de cada componente del sistema. Para la validación de la técnica se utilizaron 251 sueros de pacientes positivos para P. falciparum y 44 sueros de individuos sanos, diagnosticados utilizando la técnica de gota gruesa. Resultados. La técnica estandarizada con el péptido sintético permitió observar diferencia significativa en el reconocimiento de sueros de pacientes, controles positivos y negativos por los antígenos (extracto de proteínas y péptidos sintéticos). Conclusiones. La metodología usada permite identificar la respuestas inmune específica contra P. falciparum.

Abstract Introduction. Malaria continues being one of the diseases causing the greatest morbi-mortality around the world. For that reason, effective diagnostic tools must thus be developed which can be used in strategies for controlling the disease. Objectives. To standardise enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) conditions for detecting Plasmodium falciparum specific IgG in sera from patients diagnosed by thick smear as suffering non-complicated malaria caused by P. falciparum. A protein extract obtained from P. falciparum culture or a synthetic peptide derived from glutamate rich protein (GLURP) merozoite surface protein would be used as antigen. Materials and Methods. 22 serum samples from patients diagnosed as suffering from P. falciparum malaria, 11 serum samples from patients diagnosed as suffering from P. vivax and 44 from healthy donors, diagnosed by using the thick smear tecnique were used for standarising the technique. Serum samples were tested against parasite protein extract and GLURP- derived IMT 94 synthetic peptide for standardisign optimum dilutions and concentrations for each component in the system. 251 serum samples from patients diagnosed as suffering from P. falciparum malaria and 44 from healthy donors diagnosed by using the thick smear tecnique were used to validate the technique. Results. The technique led to significant differences being observed in antigens (protein extract and synthetic peptides) recognising serum from positive and negative patients and controls. Conclusions. The methodology used led to identifying specific immune response against P. falciparum.

Development and characterization of IgY antibodies against synthetic peptides from Brucella abortus OMP25 and BP26 proteins / Desarrollo y caracterización de anticuerpos IgY contra péptidos sintéticos de las proteínas OMP25 y BP26 de Brucella abortus

Brucellosis is a zoonose produced by bacterial species from the Brucella genus. Its isolation and identification in food using classical microbiological techniques is not practical due to its slow growth rate. Therefore, it is necessary to establish fast and specific methods for the detection of the bacteria in food. The goal of this work was the production and characterization of monospecific polyclonal antibodies in chicken (IgY) against synthetic peptides from Brucella abortus OMP25 and BP26 proteins, suitable for an antigen-capture assay. Conformational as well as antigenic predictions were performed using the ANTHEPROT package. Chemical synthesis was carried out by the multiple manual synthesis using the t-boc strategy. The peptides were used as antigens for the preparation of polyclonal antibodies in chicken. Experimental animals produced specific antibodies against the OMP25 and BP26 peptides constructs determined by ELISA and MABA assays showing correspondence between the predictive study and the immunogenicity obtained in chicken. The IgY proved to be able to recognize B. abortus by MABA assays. The binding activity and specificity of antibodies was determined by Western blot with cell extract from B. abortus. In this study, we demonstrated that OMP25 and BP26 peptides constructs are good candidates for production of specific IgY antipeptide antibodies capable of recognizing proteins from sonicated B. abortus strain S19, indicating the potential usefulness of the IgY antibody for development of immunoassays for detection of Brucella abortus.

La brucelosis es una zoonosis producida por especies del género Brucella. El aislamiento e identificación de la bacteria en alimentos usando las técnicas clásicas de microbiología no es práctico debido a su lenta tasa de crecimiento. Por lo tanto, es necesario establecer métodos rápidos para la detección de la bacteria en alimentos. En el presente trabajo se desarrollaron y caracterizaron anticuerpos policlonales monoespecíficos en gallinas (IgY) contra péptidos sintéticos de las proteínas OMP25 y BP26 de Brucella abortus, que puedan ser utilizados en un ensayo de captura. Para ello, se realizaron estudios conformacionales y de predicción de epítopes en la selección de los péptidos, los cuales se utilizaron como antígenos para la producción de las IgY. Los animales desarrollaron anticuerpos específicos contra los péptidos, mostrando correspondencia entre los estudios predictivos y la inmunogenicidad obtenida. Las IgY reconocieron a B. abortus en un ensayo de MABA y la actividad de unión y especificidad fue determinada por western blot con extracto celular de B. abortus. En este estudio, demostramos que los péptidos de las proteínas OMP25 y BP26 de B. abortus son buenos candidatos para la producción de anticuerpos IgY especificos capaces de reconocer proteínas de extracto de B. abortus cepa S19, indicando el potencial uso de anticuerpos IgY para el desarrollo de inmunoensayos para la detección de Brucella abortus.

Production and evaluation of chicken antibodies against a synthetic peptide from glial growth factor / Producción y evaluación de anticuerpos de gallinas contra un péptido sintético del factor de crecimiento glial

Neuregulins (NRG) are proteins that belong to the family of epidermal growth factors. It is well established that these factors are essential for the development and maintenance of the nervous system. Due to the difficulty of purifying enough quantities of these factors and the lack of specificity from commercially available antibodies, the aim of this work was to produce antibodies against a synthetic peptide capable to detect and identify neuregulin GGFb isoforms. To accomplish this goal, polyclonal antibodies were raised in hens against a synthetic peptide designed from the GGFb1 extracellular sequence. The sequence analysis was made using different epitope-predicting programs. Our results showed that the peptide sequence selected was immunogenic because it was capable of inducing a specific type B immune response in the experimental animal model. These antibodies were also capable of recognizing a recombinant GGF protein and GGF isoforms present in different samples. Our results suggest that the development of immunoglobulin Y (IgY) using synthetic peptides represents, a valuable tool for neuroscience research.

Las Neuregulinas (NRG) son proteínas que pertenecen a la familia de los factores de crecimiento epidermal. Se ha demostrado que estos factores son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de la funcionalidad del sistema nervioso. Debido a la dificultad para purificar estas proteínas y la falta de especificidad de los anticuerpos disponibles comercialmente, el objetivo de este trabajo fue producir anticuerpos contra un péptido sintético capaz de detectar e identificar una isoforma de la Neuregulina (GGFb). Para lograr este objetivo, se desarrollaron anticuerpos en gallinas (IgY) contra un péptido sintético diseñado a partir de la secuencia aminoacídica de la región extracelular de GGFb, utilizando programas de predicción de epítopes. Los resultados demuestran que el péptido seleccionado fue immunogénico debido a que estimuló una respuesta inmune específica tipo B en el modelo utilizado. Estos anticuerpos fueron también capaces de reconocer una proteína recombinante e isoformas de GGF presentes en diferentes muestras biológicas. Nuestros resultados demuestran el potencial valor de las inmunoglobulinas Y (IgY) contra péptidos sintéticos como una herramienta de aplicación para la investigación en neurociencia.