Analysis of whey protein hydrolysates: peptide profile and ACE inhibitory activity

The aim of this study was to prepare enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate with a nutritionally adequate peptide profile and the ability to inhibit angiotensin-converting enzyme (ACE) activity. The effects of the type of enzyme used (pancreatin or papain), the enzyme:substrate ratio (E:S ratio=0.5:100, 1:100, 2:100 and 3:100) and the use of ultrafiltration (UF) were investigated. The fractionation of peptides was performed by size-exclusion-HPLC, and the quantification of the components of the chromatographic fractions was carried out by a rapid Corrected Fraction Area method. The ACE inhibitory activity (ACE-IA) was determined by Reverse Phase-HPLC. All parameters tested affected both the peptide profile and the ACE-IA. The best peptide profile was achieved for the hydrolysates obtained with papain, whereas pancreatin was more advantageous in terms of ACE-IA. The beneficial effect of using a lower E:S ratio on the peptide profile and ACE-IA was observed for both enzymes depending on the conditions used to prepare the hydrolysates. The beneficial effect of not using UF on the peptide profile was observed in some cases for pancreatin and papain. However, the absence of UF yielded greater ACE-IA only when using papain.

O objetivo deste estudo foi preparar hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite com perfil peptídico nutricionalmente adequado e com capacidade para inibir a atividade da enzima conversora da angiotensina (ECA). Os efeitos do tipo de enzima usado (pancreatina ou papaína), da relação enzima:substrato (E:S=0,5:100, 1:100, 2:100 e 3:100) e do uso da ultrafiltração (UF) foram investigados. O fracionamento dos peptídeos foi feito por CLAE de exclusão molecular e a quantificação dos componentes das frações cromatográficas foi realizada pelo método da Área Corrigida da Fração. A atividade inibitória da ECA (AI-ECA) foi determinada por CLAE de fase reversa. Todos os parâmetros testados afetaram tanto o perfil peptídico quanto a AI-ECA. O melhor perfil peptídico foi atingido para os hidrolisados obtidos com papaína, enquanto a pancreatina foi mais vantajosa em termos da AI-ECA. O efeito benéfico do uso de menor relação E:S sobre o perfil peptídico e a AI-ECA foi observado para ambas as enzimas dependendo das condições usadas para o preparo dos hidrolisados. O efeito benéfico da ausência da UF sobre o perfil peptídico foi observado em alguns casos para pancreatina e papaína. No entanto, a ausência da UF produziu maior AI-ECA somente quando a papaína foi usada.

Perfil peptídico de hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite, obtidos pela ação da pancreatina e da papaína / Peptide profile of enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate obtained by action of pancreatin and papain

The aim of this study was to obtain enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate with high oligopeptide, especially di- and tripeptides, and free amino acid contents, besides small amounts of large peptides. Different parameters were evaluated such as type of enzyme (pancreatin and papain), enzyme:substrate ratio (0.5:100, 1:100, 2:100 and 3:100), and the use of ultrafi ltration. The peptide profi les of the hydrolysates were characterized by using a fractionation method by size-exclusion HPLC followed by a rapid Corrected Fraction Area method for quantifying the components of the chromatographic fractions. The results showed that, in terms of number of analyzed samples, the pancreatin action was more advantageous than papain. However, the best peptide profile was obtained by papain, reaching 15.29% of di- and tripeptides, 47.83% of free amino acids and 25.73% of large peptides. The use of the smallest enzyme:substrate ratio (0.5:100) was beneficial in some cases for both enzymes, while the lack of ultrafiltration was favorable just for pancreatin.

El objetivo de este trabajo fue obtener hidrolizados enzimáticos a partir de concentrado proteico de suero lácteo con elevados contenidos de oligopéptidos, especialmente di y tri péptidos, y aminoácidos libres, además de reducida cantidad de grandes péptidos. Para eso fueron evaluados algunos parámetros como el tipo de enzima (pancreatina o papaína), la relación enzima:substrato (0,5:100, 1:100, 2:100 y 3:100)y el empleo de ultrafiltración. Para evaluar el perfil peptídico, los hidrolizados se sometieron a fraccionamiento en cromatografía líquida de alta eficiencia de exclusión molecular (SE-HPLC) y para la cuantificación de los componentes de las fracciones de la cromatografía fue utilizado el método del Área Corregida de la Fracción (ACF). Los resultados indican que el uso de pancreatina fue más ventajoso que el de papaína, así como la menor relación enzima:substrato (0,5:100). Por otro lado, el mejor perfil peptídico (15,29% de di y tripéptidos, 47,83% de aminoácidos libresy 25,73% de grandes péptidos) fue conseguido con el empleo de papaína. La menor relación enzima:substrato (0,5:100) fue favorable en algunos casos para las dos enzimas. La ausencia de ultrafiltración favoreció los hidrolizados producidos con pancreatina.

O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de hidrolisados enzimáticos do concentrado proteico do soro de leite com elevado teor de oligopeptídeos, principalmente di- e tripeptídeos, e de aminoácidos livres, além de quantidade reduzida de grandes peptídeos. Para tal, foram avaliados diferentes parâmetros, como tipo de enzima (pancreatina e papaína), relação enzima:substrato (0,5:100, 1:100, 2:100 e 3:100) e o emprego da ultrafiltração. Caracterizou-se o perfil peptídico pelo fracionamento dos hidrolisados por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular e, para a quantificação dos componentes das frações cromatográficas, empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração. Os resultados obtidos indicaram que, em termos de número de casos analisados, a ação da pancreatina foi mais vantajosa do que a da papaína. Entretanto, o melhor perfil peptídico foi obtido pela açãoda papaína, dando origem a 15,29% de di- e tripeptídeos, 47,83% de aminoácidos livres e 25,73% de grandes peptídeos. A utilização da menor relação enzima:substrato (0,5:100) foi benéfica em alguns casos para ambas as enzimas, enquanto que a ausência da ultrafiltração mostrou-se favorável apenas para a pancreatina.

Efeito da remoção de fenilalanina sobre o perfil peptídico de hidrolisados proteicos da farinha de trigo / Phenylalanine removal effect on the peptide profile of hydrolyzed protein from wheat flour

Para avaliar o efeito da remoção de fenilalanina no perfil peptídico dos hidrolisados proteicos de farinha de trigo, foram preparados nove hidrolisados empregando-se a associação sucessiva de pancreatina e de extrato enzimático bruto obtido da casca de abacaxi (EB). Foram testados o efeito da ordem de adição das enzimas, da temperatura de reação, da relação enzima: substrato (E:S) e do tratamento físico da amostra. A análise do perfil peptídico dos hidrolisados foi realizada em duas etapas: antes e após a remoção da fenilalanina. A cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular foi utilizada para efetuar o fracionamento e a quantificação dos peptídeos e aminoácidos livres pela técnica da Área Corrigida da Fração. O processo de remoção de fenilalanina melhorou o perfil peptídico de três hidrolisados, mas não afetou no de cinco hidrolisados. O efeito benéfico desse processo está associado ao aumento no teor de di- e tripeptídeos ou à redução na quantidade de peptídeos grandes. O melhor perfil peptídico foi obtido após a remoção de fenilalanina, utilizando-se pancreatina E:S de 4:100 a 50°C, durante 210 min, seguidade EB E:S de 10:100 a 70°C durante 90 min.

The effect of phenylalanine removal on the peptide profile of the protein hydrolysates from wheat flour wasinvestigated. Nine hydrolysates were prepared, using a successive association of a pancreatin and a crudeenzymatic extract obtained from pineapple peel (CE), and the effect of the order of enzymes addition, thereaction temperature, the enzyme: substrate (E:S) ratio, and the physical treatment of sample were examined.The analysis of peptide profile of hydrolysates was performed in two stages, that is before and after removingphenylalanine. The size-exclusion high performance liquid chromatography was used for performing the fractionation, followed by Correct Fraction Area technique for quantifying peptides and free amino acids. The process of phenylalanine removal improved the peptide profile of three hydrolyzed samples, but it did not affect the five hydrolysates. The beneficial effect of this process is correlated with the increase of di- and tripeptides contents, or in reducing the amount of large peptides. The best peptide profile was obtained after phenylalanine removal by using pancreatin at E:S ratio of 4:100 at 50ºC for 210min, followed by CE at E:S ratio of 10:100 at 70ºC for 90 min.

Emprego da hidrólise enzimática utilizando subtilisina para elevar o valor nutricional do soro de leite / Use of enzymatic hydrolysis using subtilisin for increasing the nutritional value of whey

With the aim of increasing the nutritional value of whey, a subtilisin was used for hydrolysing its proteins and obtaining high di-tripeptide and free amino acid contents, besides small amounts of large peptides. The whey protein concentrate was used as raw material and different hydrolytic conditions were tested such as reaction time (5, 10 and 15h), enzyme:substrate ratio (1:100, 2:100 and 4:100) and raw material concentration (10% and 15%). The peptide profi les were initially characterized using a fractionation method by a size-exclusion-HPLC followed by a rapid Corrected Fraction Area method for quantifying the peptides. The action of subtilisin showed varied effects depending on the hydrolysis parameters used. The best peptide profi le was obtained using a raw material concentration of 10%, an enzyme:substrate ratio of 4:100, after 5h reaction, reaching 13.34% ofdi-tripeptides, 45.56% of free amino acids and just 12.28% of large peptides.

Con el propósito de mejorar el valor nutricional del suero lácteo, fue empleada una subtilisina para hidrolizar sus proteínas y obtener un alto contenido de di-tri péptidos, aminoácidos libres con reducción del tenor de grandes péptidos.La materia prima fue el concentrado proteico del suero lácteo y diferentes condiciones de hidrólisis fueron probadas: tiempo de hidrólisis(5, 10 y 15h), la relación enzima: substrato (1:100, 2:100 y 4:100) y la concentración de la materia prima (10% y 15%). Se caracterizó elperfi l peptídico por medio de fraccionamiento de los hidrolizados utilizando cromatografía líquida de alta efi ciencia de exclusión moleculary la cuantifi cación de los componentes de las fracciones cromatográfi cas fue realizada por el método rápido del área corregida de la fracción. Para los parámetros estudiados, se observaronefectos variados de la subtilisina en la obtención de los hidrolizados, y el mejor perfi l peptídico fue encontrado cuando se utilizó la concentración de materia prima de 10%, relación enzima: substrato de 4:100 y 5 horas de reacción. Estas condiciones dieron origen a un hidrolizado compuesto de 13,34% de di-tripeptídeos, 45,56%de aminoácidos libres y sólo 12,28% de grandes péptidos.

Com o intuito de elevar o valor nutricional do soro de leite, foi empregada uma subtilisinapara hidrolisar suas proteínas e obter alto teor de di-tripeptídios, e de aminoácidos livres, alémde pequena quantidade de grandes peptídios. A matéria-prima utilizada foi o concentrado proteico do soro de leite e diferentes condições hidrolíticas foram testadas, tais como o tempo dereação (5, 10 e 15h), a relação enzima:substrato (1:100, 2:100 e 4:100) e a concentração damatéria-prima (10% e 15%). Caracterizou-se o perfil peptídico pelo fracionamento dos hidrolisados por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular e, para a quantificação dos componentes das frações cromatográficas, empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração. Para os parâmetros estudados, observaram-se efeitos variados da subtilisina na obtenção dos hidrolisados, sendo que o melhor perfil peptídico foi encontrado ao se empregar a concentração da matéria-primade 10%, relação enzima:substrato de 4:100, após 5 h de reação, tendo obtido 13,34% de ditripeptídeos, 45,56% de aminoácidos livres e, apenas, 12,28% de grandes peptídios.

Ação da pancreatina na obtenção de hidrolisados protéicos de soro de leite com elevado teor de oligopeptídeos / Action of pancreatin for obtaining whey protein hydrolysates with high oligopeptide contents

Vários hidrolisados enzimáticos de soro de leite foram preparados visando a elevação do teor de oligopeptídeos e a redução de custos para produção em larga escala. Para isso, empregou-se a pancreatina e alguns parâmetros hidrolíticos como o tempo de reação (5, 10 e 15h), a relação E:S (1:100, 2:100 e 4:100) e a concentração do substrato (10 e 15 por cento) foram testados. Os hidrolisados foram fracionados por cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão molecular (SEHPLC) e, para a quantificação dos componentes das frações cromatográficas, empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração. Para os parâmetros estudados, observou-se efeito benéfico sobre o perfil peptídico, sendo que o melhor resultado, associado, principalmente, ao maior teor de oligopeptídeos (49 por cento) e ao menor conteúdo de aminoácidos livres (22 por cento), foi obtido quando se empregou a concentração do substrato a 10 por cento, a relação E:S de 4:100 e o tempo de reação de 10h.

Several enzymatic hydrolysates of whey were prepared with the objective of increasing the oligopeptide content and reducing the cost of large scale production. Pancreatin was used and some hydrolytic parameters such as reaction time (5, 10 and 15h), enzyme:substrate ratio (E:S) (1:100, 2:100 and 4:100) and substrate concentration (10 and 15 percent) were tested. The hydrolysates were fractionated by size-exclusion-HPLC and the rapid corrected fraction area method was used for quantifying the chromatographic fractions. The beneficial effect on the peptide profile was observed in several cases, and it was mainly associated with higher oligopeptide (49 percent) and lower amino acid (22 percent) contents, which were obtained for a substrate concentration of 10 percent, E:S ratio of 4:100 and reaction time of 10h.