Rapid identification of bovine mastitis pathogens by MALDI-TOF Mass Spectrometry / Rápida identificação de agentes causadores de mastite por espectrometria de massas MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been shown to be an alternative method for identification of bacteria via their protein profile spectra, being able to identify bacteria at the genus, species and even at subspecies level. With the aim of large-scale identification of pathogens causing mastitis by this platform, a total of 305 isolates of bacteria identified from cows with subclinical mastitis were analyzed by conventional microbiological culture (MC) as well as by MALDI-TOF MS coupled with Biotyper data processing. Approximately 89% of the identifications performed by MALDI-TOF MS were consistent with results obtained by MC. From the remaining isolates (11%), 6.3% of isolates were classified as misidentified (discordance for both genus and species level), and 4.7% showed identification agreement at the genus level but not at the species level, being classified as unidentified at species level. The disagreement results were mostly associated with identification of Streptococcus and Enterococcus species probably due to the narrow phenotypic similarity between these two genera. These disagreement results suggest that biochemical assays might be prone to identification errors and, MALDI-TOF MS therefore may be an alternative to overcome incorrect species-specific identification. Standard microbiological methods for bovine mastitis diagnosis are time consuming, laborious and prone to errors for some bacteria genera. In our study, we showed that MALDI-TOF MS coupled with Biotyper may be an alternative method for large-scale identification of bacteria isolated from milk samples compared to classical microbiological routine protocols.(AU)

A espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) tem mostrado ser um método alternativo para a identificação de bactérias, sendo capaz de identificar as bactérias causadoras de mastite em gênero, espécie ou até mesmo subespécie. Com o objetivo de identificar os patógenos causadores de mastite em grande-escala por esta plataforma, um total de 305 isolados bacterianos oriundos de vacas com mastite subclínica foram analisados pela cultura microbiológica convencional (CM) e pela MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper. Aproximadamente 89% das identificações realizadas pela MALDI-TOF MS foram consistentes com os resultados obtidos pela CM. Do restante de isolados bacterianos (11%), 6,3% foram classificados como identificação errônea (discordância de gênero e espécie), e 4,7% apresentaram concordância de gênero, mas discordância da espécie. Os resultados que apresentaram divergência estavam mais associados com a identificação das espécies de Streptococcus spp. e Enterococcus spp. devido à similaridade fenotípica entre os dois gêneros. Estes resultados divergentes sugerem que os ensaios bioquímicos podem ser propensos a erros de identificação, por isso a MALDI-TOF MS pode ser considerada um método alternativo para superar os erros de identificação da CM. A cultura microbiológica padrão e os ensaios bioquímicos utilizados na identificação de agentes causadores de mastite são demorados, trabalhosos e propensos a erros quando utilizados na identificação em nível de espécie. No presente estudo, demonstramos que a MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper pode ser considerada um método alternativo de identificação de bactérias causadoras de mastite em grande-escala quando comparado com a cultura microbiológica convencional.(AU)

Análisis proteómico del veneno de la abeja africanizada: comparación de métodos de extracción / Proteomic Analysis of Africanized Bee Venom: a Comparison of Protein Extraction Methods

La abeja africanizada es la más común en la apicultura colombiana y a su veneno (apitoxina) se le han atribuido propiedades terapéuticas para diferentes enfermedades, sin mayor soporte científico. Al revisar en la literatura los reportes publicados sobre el análisis proteómico de la apitoxina, se encontraron cuatro métodos distintos para la extracción de proteínas de la apitoxina. El primer método consiste en resuspender la apitoxina en Urea 7 M, precipitar con acetona y finalmente resuspender en Urea 7 M y CHAPS 4 %. Para el segundo método se resuspende la apitoxina en buffer de lisis, se precipita con ácido tricloroacético, y luego se resuspende en Urea 7 M y CHAPS 4 %. El tercer método es igual al anterior, excepto que la precipitación se realiza con acetona en vez de ácido tricloroacético. Finalmente, el cuarto método consiste en resuspender la apitoxina en agua destilada, precipitar con acetona y resuspender en Urea 7 M y CHAPS 4 %. Este trabajo se enfocó en comparar el desempeño de estos cuatro métodos de extracción y determinar el método con el mejor resultado en cuanto a la concentración e integridad obtenida de las proteínas. De los distintos métodos evaluados, se encontró que los mejores resultados en cuanto a concentración de proteínas se obtuvieron con la resuspensión de apitoxina en buffer de lisis y precipitación con acetona (método 3) y con el método de resuspensión de apitoxina en agua destilada y precipitación con acetona (método 4). De estos, el mejor método de extracción en cuanto a integridad de las proteínas y perfil proteómico fue el de resuspensión de apitoxina en buffer de lisis seguido de precipitación con acetona (método 3).

The Africanised bee is the most common type of bee in Colombia, and therapeutic properties for different diseases have been attributed to its venom, without much scientific support. A literature search of reports on the proteomic analysis of honeybee venom yielded four different methods for extracting proteins from bee venom. The first method consists in resuspending the venom in 7 M Urea, followed by precipitation with acetone and finally resuspending the pellet in 7 M Urea and 4 % CHAPS. For the second method, the venom is resuspended in lysis buffer, precipitated with trichloroacetic acid, and then resuspended in 7 M Urea and 4 % CHAPS. The third method is similar to the previous one, except that the precipitation step is performed with acetone instead of trichloroacetic acid. Finally, the fourth method is to resuspend the venom in distilled water, precipitate with acetone and resuspend in 7 M Urea and 4 % CHAPS. This work focused on comparing the performance of these four extraction methods, in order to determine the method with the best results in terms of concentration and integrity of the proteins obtained. Of the four methods evaluated, the best results in terms of protein concentration and yield were obtained by resuspending the bee venom in lysis buffer followed by precipitation with acetone (method 3), and by resuspending in distilled water followed by precipitation with acetone (method 4). Of these, the method that maintained protein integrity and yielded the best proteomic profile was that in which the bee venom was resuspended in lysis buffer followed by precipitation with acetone (method 3).

Efeito da administração de propileno glicol e cobalto associado à vitamina B12 sobre o perfil metabólico e a atividade enzimática de ovelhas da raça Santa Inês no periparto / Effect of propylene glycol, cobalt and vitamin B12 on the metabolic profile and enzymatic in Santa Inês ewes in peripartum

(AU)O presente estudo teve por objetivo avaliar a influência da administração de propileno glicol e cobalto associado à vitamina B12 sobre o perfil metabólico e a atividade enzimática de ovelhas da raça Santa Inês no período do periparto. Foram utilizadas 18 ovelhas prenhes, pesando em torno de 40kg. Aproximadamente 30 dias antes da data prevista para o parto foram separadas de maneira aleatória em três grupos e administrados os suplementos conforme a seguir: (G1/n=6) grupo que recebeu propileno glicol (30mL por via oral diariamente); (G2/n=6) grupo que recebeu cobalto (1mg de cloreto de cobalto a 1%, via oral diariamente) associado a vitamina B12 (2mg via intramuscular, semanalmente) e (G3/n=6) grupo controle. As amostras de sangue das ovelhas para avaliação do perfil metabólico e enzimático (glicose, β-hidroxibutirato-BHB, NEFA, proteína total, albumina, uréia, creatinina, AST, GGT, FA e CK) foram colhidas 30 dias antes da data prevista para o parto, uma semana antes (ante-parto), no parto, às 24h, 72h, 5 dias, 15 dias e 30 dias após o parto. Não foi observado cetonúria nos momentos que antecederam ao parto. A administração dos suplementos não influenciou sobre o perfil metabólico, protéico e energético, assim como não houve comprometimento hepático das ovelhas no período do periparto.(AU)

The aim of this study was to evaluate the influence of the administration of propylene glycol and cobalt associated with vitamin B12 on the metabolic profile and enzymatic activity of Santa Inês ewes in the peripartum period. A total of 18 pregnant ewes, weighing around 40kg were used. Approximately 30 days before the expected date of delivery were randomly separated into three groups and administered supplements as follows: (G1/n = 6) group received propylene glycol (30mL orally daily); (G2/n = 6) group receiving cobalt (1mg cobalt chloride 1%, orally daily) associated with vitamin B12 (2mg intramuscular weekly) and (G3/n = 6) control group. Blood samples from ewes to evaluate the enzymatic and metabolic profile (glucose, β-hydroxybutyrate, BHB, NEFA, total protein, albumin, urea, creatinine, AST, GGT, ALP and CK) were taken 30 days before the date set for delivery, one week before (ante partum), delivery at 24h, 72h, 5 days, 15 days and 30 days after delivery. ketonuria was not observed in pre partum. The administration of supplements had no effect on the metabolic profile, protein and energy, and no liver disorders was observed in peripartum.(AU)

Caracterização das proteínas de superfície de membrana externa da sorovariedade Hardjo isolada de bovinos em Minas Gerais / Characterization of outer membrane proteins of serovar Hardjo isolated from cattle in Minas Gerais, Brazil

Foram identificadas diferenças no perfil protéico das amostras de Sponselee, Norma e Hardjoprajitno, com bandas protéicas entre 175, 47 kDA e 12,10 kDa. A amostra Sponselee foi a que apresentou maior número de bandas (12), seguida da Norma que apresentou 11 bandas e de Hardjoprajitno que apresentou 9 bandas. Todas as bandas observadas na amostra Sponselee possuíam correspondentes nas outras duas amostras. A amostra Norma não apresentou uma banda em torno de 35,77 kDa e a Hardjoprajitno não apresentou bandas em torno de 89,59 kDa, 35,77 kDa e 12,10 kDa. O reconhecimento dessas proteínas por soros hiperimunes contra cada uma das amostras também mostrou diferenças, sendo que o maior número de proteínas reconhecido em todas as amostras por todos os soros se encontrou entre 35,83 kDa e 29,19 kDa. Os soros contra bovino na amostra Norma só reconheceu proteínas de baixa massa molecular nas amostras Norma (6,80 kDa) e Hardjoprajitno (6,80 kDa e 5,30 kDa). Soro bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu uma proteína de 44,33 kDa todas às amostras e proteínas de 4,22 kDa nas amostras Sponselee e Norma e de 10,49 kDa e 6,16 kDa na Hardjoprajitno. As diferentes proteínas identificadas poderiam se constituir em alvos específicos para o desenvolvimento de testes diagnósticos e vacinas contra leptospirose bovina.

Differences in the protein profile of Leptospira sp. strains Sponselee, Norma and Hardjoprajitno were observed, with bands ranging from 175.47 kDa to 12.10 kDa. Strain Sponselee presented a 12-band profile, while strain Norma showed 11 and strain Hardjoprajitno showed 9 bands in the profile. All bands observed in Sponselee strain profile could match bands in the other two strains. Strain Norma lacks a band at 35.77 kDa and strain Hardjoprajitno lacks the bands at 89.59 kDa, 35.77 kDa and 12.10 kDa. The recognition profile from hyperimmune sera was also different for the studied serovar Hadjo strains. The majority of recognized proteins was in the range of 35.83 kDa to 29.19 kDa. Cattle sera against strain Norma only recognized low molecular mass proteins in strains Norma (6.80 kDa) and Hardjoprajitno (6.80 kDa and 5.30 kDa). Bovine sera against strain Hardjoprajitno recognized a 44.33 kDa protein in all studied strains and proteins of 4.22 kDa in strains Sponselee and Norma and of 10.49 kDa and 6.16 kDa in strain Hadjoprajitno. The different identified proteins could become specific targets to the development of diagnostic tests and vaccines against bovine leptospirosis.

Perfil proteico e metabolismo oxidativo de cordeiros experimentalmente infectados pelo Haemonchus contortus e suplementados com selênio e vitamina E / Protein Profile and oxidative metabolism of lambs experimentally infected with Haemonchus contortus and supplemented with selenium and vitamin E

Para avaliar a influência da suplementação com selênio e vitamina E sobre o perfil proteico e metabolismo oxidativo de cordeiros infectados experimentalmente pelo Haemonchus contortus, trinta cordeiros fêmeas foram distribuídos em quatro grupos: G1 (n=10): animais infectados; G2 (n=10): infectados e suplementados; G3 (n=5): controle; e G4 (n=5): não infectados e suplementados. Os grupos 1 e 2 receberam 500 larvas de H. contortus (L3), via oral, por um período de 20 dias, com intervalo de dois dias entre as doses. A suplementação nos grupos 2 e 4 foi realizada no dia zero, com 0,1mg kg-1 de Selenito de sódio (1,67 por cento) e com 2.000UI de vitamina E por via intramuscular (IM). Somente a vitamina E foi reaplicada no dia 30. As coletas de sangue para determinação do perfil proteico (proteína total, albumina, alfa, beta e gamaglobulina) e metabolismo oxidativo (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico-TBARS e a enzima glutationa peroxidase (GSPX) foram realizadas nos dias zero, 20, 30, 45, 60 e 80. OPG foi quantificado nos dias 0, 20 ,45 e 80. Em relação aos valores de proteínas totais, albumina, betaglobulina e gamaglobulina, as principais diferenças foram observadas quando os grupos parasitados foram comparados com o grupo somente suplementado; e este manteve valores mais elevados. Conclui-se que não há influência da suplementação com selênio e vitamina E no perfil proteico e metabolismo oxidativo quando os cordeiros se encontram severamente parasitados por H.contortus.

The objective of the present study was to describe the influence of supplementation with selenium and vitamin E on the protein and oxidative profiles of lambs experimentally infected with Haemonchus contortus. Thirty female lambs were divided into four groups as follows: G1 (n=10): infected animals; G2 (n=10): infected and supplemented; G3 (n=5): control; G4 (n=5): non-infected and supplemented. Groups 1 and 2 received 500 H. contortus larvae (L3) orally for a period of 20 days, with 2-day intervals between doses. Supplementation in groups 2 and 4 was performed on day zero by injecting 0.1mg kg-1 of sodium selenite solution (1.67 percent) and 2,000IU vitamin E through the intramuscular (IM) route. Vitamin E alone was injected once again on day thirty. The blood samples to determine the protein profile (total protein, albumin, alpha, beta and gamma) and oxidative metabolism (species reactive to thiobarbituric acid and glutathione peroxidase (GSPX) were performed on days zero, 20, 30, 45, 60 and 80. The OPG was quantified on days 0, 20, 45 and 80. Regarding the values of total proteins, albumin, beta and gamma globulins, the main differences were observed when the parasitized groups were compared to the supplemented, non-infected group, the latter exhibiting higher values. It is concluded that there is no influence of supplementation with vitamin E and selenium in the protein profile and oxidative metabolism when the lambs are severely parasitized with H. contortus.

Efeito da inclusão de fontes lipídicas na dieta de cabras em lactação sobre os parâmetros sanguíneos / Effect of fat source inclusion in the diet of lactating goats

Conduziu-se o estudo do perfil metabólico, com o objetivo de avaliar o estado nutricional ou possíveis distúrbios metabólicos que podem comprometer a saúde e, consequentemente, o desempenho do rebanho. No presente trabalho foi avaliado o perfil metabólico de cabras em lactação, submetidas a dietas com diferentes fontes de lipídios. Foram utilizadas 16 cabras da raça Saanen com peso vivo médio de 35 Kg e produção média diária de 1,2 kg de leite, distribuídas em quadrado latino com três repetições. Os tratamentos experimentais consistiram nas seguintes dietas: sem suplementação lipidica (TC); semente de faveleira (SF); torta de faveleira (TF) e caroço de algodão (CA). O experimento foi desenvolvido em quatro períodos experimentais de 14 dias, sendo 10 dias de adaptação à dieta e quatro dias de coleta de dados. No último dia de cada período foram coletadas amostras de sangue. A inclusão de semente de oleaginosa na dieta de cabras em lactação diminuiu o consumo de matéria seca por unidade metabólica (CMSU) e consumo de proteína bruta por unidade metabólica (CPBU). Dentre os quatro tratamentos não se observou diferença significativa no que se refere à concentração sérica de uréia, creatinina, GGT (gama glutamiltransferase), cálcio, fósforo, magnésio e glicose. Os níveis séricos de albumina dos animais que receberam TF foram maiores (P<0,05) do que os animais do grupo controle. Este trabalho sugere que as fontes de oleaginosas podem ser utilizadas na suplementação lipídica de cabras Saanen em lactação, entretanto animais alimentados com TF apresentaram um perfil metabólico mais saudável em função da suplementação lipídica.

The study of the metabolic profile has as objective to evaluate the nutritional status or possible metabolic disturbances that can damage the health and consequently the herd performance. In this work, the metabolic profile of lactating goats was evaluated, submitted to diets with different fat sources. 12 Saanen goats with BW of 35 kg and daily milk production of 1,2 kg were used, distributed into a Latin square with three repetitions. The diet comprised, without fat supplementation, TC (control) and with fat supplementation: SF (favelone seed); TF (favelone cake) and CA (cotton seed).The experiment was developed in four experimental periods of 14 days, with 10 days of adaptation to diets and four days for samples collection. In the last day of each period were collected blood samples. The inclusion of oleaginous seed into the lactating goats' diet decreased the dry matter consumption for metabolic unit (CMU) and consumption of crude protein for metabolic unit (CPMU). No significant differences in serum urea, creatinine, GGT (gamma glutamyltransferase), calcium, phosphorus, magnesium or glucose values were noticed in any of the four treatments. The serum levels of albumin in the animals that received TF were higher (P<0.05) than the animals of the control group. This work suggests that the oleaginous sources can be used as fat supplementation of lactating Saanen goats; however, animals fed the TF showed a healthier metabolic profile due to the fat supplement.

Protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different periods of development / Perfil protéico em ovos embrionados e liofilizados de galinha com diferentes dias de desenvolvimento

This article presents the protein profile in freeze-dried chicken embryo eggs with different development periods (0, 3, 5, 7, 9, 11 days). The protein profile was determined through HPLC-reverse phase, electrophoresis SDS-PAGE and IFE-electrophoresis. Protein profile of these eggs changes according to the period of development and the change is more evident after the 5th day, where there was an increase in ovalbumin, ovotransferrin, apoLDL, apoHDL and lysozyme concentration, and a decrease in ovomucin and ovostatin concentration. The hypothesis that the change in the protein profile is due to protein biosynthesis and disintegration that happens during incubation process is discussed.

Este artigo mostra o perfil protéico em ovos de galinha embrionados e liofilizados com diferentes períodos de desenvolvimento (0, 3, 5, 7, 9, 11 dias). O perfil protéico foi determinado por CLAE-fase reversa, eletroforese SDS-PAGE e eletroforese de focalização isoelétrica. O perfil protéico destes ovos não é igual, sendo que a diferença fica mais evidente a partir do 5º dia de desenvolvimento onde há um aumento da concentração das proteínas ovalbumina, ovotransferrina, apoLDL, apoHDL e lisozima, e diminuição da concentração da ovomucina e ovostatina, por estarem associadas ao desenvolvimento de tecidos e órgãos embrionários.