ABSTRACT
RESUMEN Introducción: Los productos naturales con actividad farmacológica requieren de evaluaciones preclínicas que justifiquen su empleo sobre una base científica. El ensayo de pirógenos es una prueba dentro de la Farmacología de Seguridad que se realiza para determinar la presencia de endotoxinas y constituye un método valioso, para demostrar la seguridad de bioderivados con potencial prebiótico en el campo de la inmunonutrición. Objetivo: Evaluar la pirogenicidad de bioproductos fúngicos de Pleurotus ostreatus (extractos acuosos del micelio y cuerpos fructíferos) y un biopreparado de levadura Kluyveromyces marxianus, empleando el ensayo de pirógenos en conejos Nueva Zelanda. Método: Se ensayaron concentraciones de 1,0 y 10,0 mg/mL de cada muestra por vía endovenosa en dosis de 0,5 y 5,0 mg/kg de peso. El diseño experimental cumplió las buenas prácticas de laboratorio según lo establecido por el International Council for Laboratory Animals Science y se realizó de acuerdo a los procedimientos normalizados de trabajo del Centro de Toxicología y Biomedicina, Santiago de Cuba. Resultados: Los extractos de Pleurotus ostreatus y el biopreparado de levadura (0,5 mg/kg) no mostraron signos de pirogenicidad. En los resultados del biopreparado (5,0 mg/kg), los valores de temperatura caen en un rango de incertidumbre, según la Farmacopea de Estados Unidos (USP) y se sugirió repetir el estudio. Conclusiones: Los extractos de Pleurotus ostreatus y el biopreparado de Kluyveromyces marxianus (0,5 mg/kg) no indujeron un aumento de temperatura significativo en los animales, lo cual sugiere que en estos bioproductos no existen niveles de endotoxinas que puedan provocar pirogenicidad.
ABSTRACT Introduction: Natural products with pharmacological activity require preclinical evaluations to justify their uses scientifically. The pyrogen assay is a safety pharmacology test performed to determine the presence of endotoxins and it is a valuable method to demonstrate the bio-derivative products safety and their prebiotic potential in the field of immunonutrition. Objective: To evaluate the pyrogenicity of fungal bioproducts from Pleurotus ostreatus (aqueous extracts from mycelium and fruiting bodies) and a biopreparation from Kluyveromyces marxianus yeast, using a pyrogen assay in New Zealand rabbits. Method: Concentrations of 1.0 and 10.0 mg/mL of each sample were tested intravenously at doses of 0.5 and 5.0 mg/kg body weight. The experimental design complied with good laboratory practices as established by the International Council for Laboratory Animal Science and was carried out according to the standard work procedures of the Centro de Toxicología y Biomedicina, Santiago de Cuba. Results: Pleurotus ostreatus extracts and the yeast biopreparation (0.5 mg/kg) showed no signs of pyrogenicity. In the biopreparation results (5.0 mg/kg), temperature values fall in the uncertainty range according to the United States Pharmacopoeia (USP), and therefore it was suggested to repeat the study. Conclusions: Pleurotus ostreatus extracts and Kluyveromyces marxianus biopreparation (0.5 mg/kg) did not induce a significant temperature increase in the animals, thereby suggesting that there are no endotoxin levels in such bioproducts that could cause pyrogenicity.
RESUMO Introdução: Produtos naturais com atividade farmacológica requerem avaliações pré-clínicas que justifiquem seu uso em bases científicas. O ensaio de pirogênio é um teste dentro da Farmacologia de Segurança que é realizado para determinar a presença de endotoxinas e é um método valioso para demonstrar a segurança de bioderivados com potencial prebiótico no campo da imunonutrição. Objetivo: Avaliar a pirogenicidade de bioprodutos fúngicos de Pleurotus ostreatus (extratos aquosos do micélio e corpos de frutificação) e de uma biopreparação da levedura Kluyveromyces marxianus, utilizando o ensaio pirogênico de coelho da Nova Zelândia. Método: Concentrações de 1,0 e 10,0 mg/mL de cada amostra foram testadas por via intravenosa nas doses de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso. O desenho experimental obedeceu às boas práticas laboratoriais estabelecidas pelo Conselho Internacional para a Ciência dos Animais de Laboratório e foi realizado de acordo com os procedimentos de trabalho padrão do Centro de Toxicologia e Biomedicina, Santiago de Cuba. Resultados: Os extratos de Pleurotus ostreatus e a biopreparação de leveduras (0,5 mg/kg) não apresentaram sinais de pirogenicidade. Nos resultados da biopreparação (5,0 mg/kg), os valores de temperatura estão dentro de uma faixa de incerteza, segundo a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) e foi sugerido repetir o estudo. Conclusões: Os extratos de Pleurotus ostreatus e a biopreparação de Kluyveromyces marxianus (0,5 mg/kg) não induziram um aumento significativo da temperatura nos animais, o que sugere que não há níveis de endotoxinas nesses bioprodutos que possam causar pirogenicidade.
ABSTRACT
A comparison of methodologies for detection of pyrogens in pharmaceutical products was performed. The rabbit pyrogen test was optimized and the dose-response curve was obtained for the 2nd International Standard for bacterial endotoxins, establishing 13.81 EU/mL/kg as the concentration of endotoxin necessary to induce a temperature rise of 0.5ºC. The 0.5ºC cut-off was shown to give results that were more compatible with the pyrogenic doses for humans. The Limulus amoebocyte lysate test (LAL) was standardized with gel-clot and chromogenic endpoints, and used for the comparative evaluation of pharmaceutical products showing good agreement. The use of beta-glucan-reactive and non-reactive LAL reagents identified some products with false-positive results. The interference test was carried out and the specifications validated for some new products as the maximum valid dilution. The results emphasized the importance and limitations of the assays recommended for the evaluation of purity and quality control of parenteral medicinal products, improving the existing methodologies in the context of reduction and replacement in the use of animal models.
Realizou-se a comparação de metodologia para avaliação de pirogênios em produtos farmacêuticos. Otimizou-se o teste da hipertermia em coelhos elaborando a curva dose-resposta com o 2º Padrão Internacional de endotoxinas bacterianas, com base na qual determinou-se a concentração de 13,81 UE/mL por kg de peso corporal, necessária para produzir aumento de temperatura de 0,5ºC. Observou-se que o limite de 0,5ºC forneceu resultados comparáveis com as doses pirogênicas para o homem. Padronizou-se o teste do lisado de amebócitos do Limulus (LAL) com determinação do ponto final cromogênico e por geleificação, que foram utilizados para a avaliação de produtos farmacêuticos obtendo-se resultados concordantes. Avaliaram-se as respostas de reagentes LAL reativos e não-reativos a beta-glicanos, observando diferenças que poderiam reprovar amostras com base em resultados falso-positivos. Executou-se o teste de interferências, validou-se o procedimento e estabeleceu-se a máxima diluição válida para produtos farmacêuticos sem especificações farmacopéicas. Os resultados enfatizam a importância e as limitações dos ensaios preconizados para avaliação da pureza e controle da qualidade de produtos farmacêuticos parenterais, contribuindo para aprimorar as metodologias existentes no contexto da redução e substituição dos modelos animais.