Aislamiento y caracterización de bacterias productoras de biopolimeros a partir de efluentes industriales / Isolated and characterization of biopolymer producing bacteria from industrial effluents

RESUMEN Se realizó una caracterización físico-química de los efluentes procedentes de industrias del sector educación, metalmecánico, lácteos y confitería de la ciudad de Manizales, Caldas; posteriormente se obtuvieron aislamientos, en medios diferenciales suplementados, de bacterias con potencial para la producción de biopolímeros a los cuales se les aplicó pruebas para la caracterización morfológica, bioquímica y molecular. Los parámetros físico químicos obtenidos de los efluentes industriales demuestran diferencias entre ellos, ya que cada industria genera diferentes residuos aportando una determinada contaminación al efluente, se obtuvieron 73 aislamientos productores de exopolisacáridos (EPS) y 101 productores de polihidroxialcanoatos (PHA), con características morfológicas y bioquímicas variables. El estudio muestra que los efluentes industriales son una gran fuente de bacterias de interés para la producción de diversos polímeros microbianos; principalmente aquellos que producen polímeros tipo biopoliésteres intracelulares como PHA, debido a su variabilidad físico-química y nutricional permitiendo que los microorganismos se adapten a diversas características medioambientales y de composición.

ABSTRACT A physical-chemical characterization of effluents from industries in the education, metal-mechanic, dairy and confectionery sectors of the city of Manizales, Caldas; Later isolates were obtained, in differential media supplemented, from bacteria with potential for the production of biopolymers to which they were applied tests for morphological, biochemical and molecular characterization. The physical chemical parameters obtained from the industrial effluents show a difference between them, since each industry generates different waste contributing a certain contamination to the effluent, 73 isolates producing exopolysaccharides (EPS) and 101 producers of polyhydroxyalkanoates (PHA) were obtained, with morphological characteristics and variable biochemistry. The study shows that industrial effluents are a great source of bacteria of interest for the production of various microbial polymers; mainly those that produce polymers like intracellular biopolyesters such as PHA, due to their physical-chemical and nutritional variability allowing the microorganisms to adapt to diverse environmental and compositional characteristics.

Polyhydroxyalkanoate biosynthesis by oxalotrophic bacteria from high Andean soil / Biosíntesis de polihidrxialcanoato por bacterias oxalotróficas de suelos altoandinos / Biossínteses de polihidroxialcanoato por bactérias oxalotróficas de solos andinos

Abstract Oxalate is a highly oxidized organic acid anion used as a carbon and energy source by oxalotrophic bacteria. Oxalogenic plants convert atmospheric CO2 into oxalic acid and oxalic salts. Oxalate-salt formation acts as a carbon sink in terrestrial ecosystems via the oxalate-carbonate pathway (OCP). Oxalotrophic bacteria might be implicated in other carbon-storage processes, including the synthesis of polyhydroxyalkanoates (PHAs). More recently, a variety of bacteria from the Andean region of Colombia in Narino have been reported for their PHA-producing abilities. These species can degrade oxalate and participate in the oxalate-carbonate pathway. The aim of this study was to isolate and characterize oxalotrophic bacteria with the capacity to accumulate PHA biopolymers. Plants of the genus Oxalis were collected and bacteria were isolated from the soil adhering to the roots. The isolated bacterial strains were characterized using biochemical and molecular biological methods. The consumption of oxalate in culture was quantified, and PHA production was monitored in batch fermentation. The polymeric composition was characterized using gas chromatography. Finally, a biosynthetic pathway based on our findings and on those from published sources is proposed. Strains of Bacillus spp. and Serratia sp. were found to metabolize calcium oxalate and synthesize PHA.

Resumen El oxalato es un anión de ácido orgánico altamente oxidado usado como fuente carbono y energía por bacterias oxalotróficas. Las plantas oxalogénicas convierten CO2 atmosférico en ácido oxálico y sales oxálicas. La formación de sales de oxalato actúa como un sumidero de carbono en ecosistemas terrestres via oxalato-carbonato (OCP). Las bacterias oxalotróficas podrían estar implicadas en otros procesos de almacenamiento de carbono, incluyendo la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHAs). Recientemente, una variedad de bacterias de la región andina colombiana en Nariño ha sido reportada por su habilidad para producir PHAs. Estas especies pueden degradar oxalato y participar en la vía del oxalato-carbonato. El objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar bacterias oxalotróficas con capacidad de acumular biopolímeros PHA. Se colectaron plantas del genero Oxalis y se aislaron bacterias del suelo adheridas a las raíces. Las cepas bacterianas aisladas se caracterizaron usando métodos bioquímicos y de biología molecular. Se cuantificó el consumo de oxalato en cultivo, y se monitoreó la producción de PHA en fermentación por lotes. La composición polimérica se caracterizó usando cromatografía de gases. Finalmente, se propone una via biosintética basada en nuestros hallazgos y en los de otras fuentes publicadas. Se encontró que las cepas de Bacillus spp. y Serratia sp. metabolizan oxalato de calcio y sintetizan PHA.

Resumo O oxalato é um ânion de ácido orgânico altamente oxidado utilizado como fonte de carbono e nergía por bactérias oxalotróficas. As plantas oxalogênicas convertem CO2 atmosférico em ácido oxálico e sais oxálicos. A formação de sais de oxalato atua como um sumidouro de carbono em ecossistemas terrestres via oxalato-carbono (OCP). As bactérias oxalotróficas poderiam estar envolvidas em outros processos de armazenamento de carbono, incluindo a sínteses de polihidroxialcanoatos (PHAs). Recentemente, uma variedade de bactérias da região Andina colombiana no Departamento de Nariño foi reportada devido a sua habilidade para produzir PHAs. Estas espécies podem degradar oxalato e participar na via oxalato-carbono. O objetivo de esse estudo foi isolar e caracterizar bactérias oxalotróficas com capacidade de acumular biopolímeros PHA. Plantas do género Oxalis foram coletadas e se isolaram bactérias do solo aderido a suas raízes. As cepas bacterianas isoladas se caracterizaram utilizando métodos bioquímicos e de biologia molecular. O consumo de oxalato em cultivo foi quantificado, e a produção de PHA foi monitorada em fermentação por lotes. A composição polimérica se caracterizou utilizando Cromatografia de Gases. Finalmente, se propõe uma via biossintética baseada em nossos resultados juntamente com resultados da literatura. Se encontrou que as cepas de Bacillus spp. e Serratia sp. metabolizam oxalato de cálcio e sintetizam PHA.

Análisis de las polihidroxialcanoato sintasas (PhaC1 y PhaC2) en una cepa de Pseudomonas fluorescens IBUN S1602, aislada en suelos colombianos / Analysis of polyhydroxyalkanoate synthases (PhaC1 and PhaC2) in a strain of Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 isolated from Colombian soil

La cepa Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 conforma el grupo de aislamientos provenientes de suelos colombianos de caña de azúcar, que acumula polihidrioxialcanoato (PHA), fue seleccionada como promisoria para escalamiento comercial por tener afinidad por sustratos alternativos y económicos como el glicerol, aceites usados, suero de leche, entre otros. Dada la importancia de la enzima sintasa en la síntesis de los PHAs, en el presente trabajo se realizó el análisis molecular de los genes phaC1 y phaC2 que codifican las enzimas sintasas tipo II (PhaC1 y PhaC2). Para la obtención de los amplímeros requeridos en la secuenciación, se utilizó la técnica de PCR bajo condiciones estandarizadas para iniciadores diseñados reportados en las bases de datos. Se identificaron dos fragmentos de 1680 pb y 1683 pb correspondientes a phaC1 y phaC2. El análisis comparativo de las secuencias proteicas resultantes de estos genes demuestra que la sintasa IBUN S1602 contiene la región α/β hidrolasa y 8 residuos de aminoácidos conservados, que son características de las sintasas examinadas a nivel mundial. Se analizó la estructura enzimática a nivel primario y se predijo la secundaria. Se concluyó que las sintasas de la cepa Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 presentan alta homología con las sintasas tipo II que se reportan para Pseudomonas. Los resultados obtenidos contribuyen al entendimiento básico de la biosíntesis de PHA, la cual permitirá, en un futuro, el aumento de la calidad de PHA debida a la modulación del nivel de sintasa que se exprese en un organismo recombinante, con el fin de variar el peso molecular del biopolímero, propiedad esencial en el estudio de aplicaciones industriales.

The strain Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 forms the group of isolates from colombian sugarcane soil´s, which accumulates polyhydroxyalkanoate biopolymer (PHA) and was selected as promising for commercial scale by having affinity for economic and alternative substrates such as glycerol, oils, whey, among others. Given the importance of the synthase enzyme in the synthesis of PHAs, was realized the molecular analysis of genes phaC1 and phaC2 which encode type II synthases (PhaC1 y PhaC2). To obtain the amplimers required in the sequencing, was used the PCR technique under standardized conditions for primers designed based on the updated review in databases. Were identified two fragments of 1680 bp and 1683 bp for phaC1 and phaC2. Comparative analysis of the resulting protein sequences of these genes shows that the IBUN S1602 synthases containing the region α/β hydrolase and 8 conserved amino acid residues that are characteristic of synthases examined worldwide. Enzyme structure was analyzed at the primary level and was predicted the secondary. It is concluded that synthase strain Pseudomonas fluorescens IBUN S1602 has high homology with type II synthases that are reported for Pseudomonas. The results contribute to basic understanding of the biosynthesis of PHA, and will allow in the future, increasing the quality of PHA due to modulation of the level of synthase is expressed in a recombinant organism, in order to vary the weight molecular biopolymer, an essential property in the study of industrial applications.