ABSTRACT
La pulpa dental contiene tejido conectivo rico en proteínas, mayormente colágeno. El objetivo de este trabajo fue describir un método de purificación de componentes orgánicos pulpares humanos y bovinos, vital y necrótico para validar el modelo experimental bovino. Se prepararon extractos con 50 mg de fracción media de pulpas unirradiculares, 20 humanas o 1 bovina, en 500 µL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, floruro de fenil metil sulfonilo 1mM e hidrocloruro de benzamidina 5 mM frío. Se homogeneizó y centrifugó a 10000 rpm. Los sobrenadantes fueron parcialmente purificados con sulfato de protamina 1%, los sedimentos resuspendidos y dializados 2 horas con recambio en acetato de sodio 500 mM pH 6. Se determinaron proteínas, hidroxiprolina e hidratos de carbono, y se calculó el rendimiento según el contenido de hidroxiprolina. Se aplicó electroforesis en geles de poliacrilamida. Se encontró mayor contenido orgánico en tejido humano que en bovino, y en vital que en necrótico. Por hidroxiprolina/proteínas y rendimiento, el extracto bovino contendría mayor proporción de colágeno. En pulpas humanas se obtuvieron bandas a 78 y 80 kDa, y en bovinas a 74 y 76 kDa. No hubo diferencias entre tejido vital y necrótico. Las evidencias cuali y cuantitativas expresadas validarían al modelo bovino en investigaciones endodónticas.
The dental pulp contains connective tissue and is rich in proteins, mainly collagen. The aim of this study was to describe a purification method for organic compounds of human and bovine pulp tissues, either vital as necrotic, in order to validate the experimental bovine model. Extracts of 50 mg of the middle fraction of one root pulp teeth, 20 humans or 1 bovine, in 500 µL of cold 50 mM Tris - HCl pH 7.4, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride and 5 mM benzamidine hydrochloride were prepared. Extracts were homogenized and centrifuged at 10000 rpm. Supernatants were partially purified with 1% protamine sulphate, sediments re-suspended and dialyzed during 2 hours with a spare in 500 mM sodium acetate pH 6. Proteins, hydroxiproline and carbohydrates were determined, and the yield of the process was calculated according to the hydroxiproline content. Poliacrylamide gel electrophoresis was applied. A greater organic content was found in human than in bovine tissue, and in vital rather than in the necrotic one. Hydroxyproline/ proteins and yield evidenced that bovine extract would contain a larger proportion of collagen. Bands at 78 and 80 kDa in human pulp and at 74 and 76 kDa in the bovine tissue were observed. There was no difference between vital and necrotic tissues. The qualitative and quantitative evidences expressed in this work would validate the bovine research endodontic model.
A polpa dentária contém tecido conectivo rico em proteínas, na sua maioria colágeno. O objetivo deste trabalho foi descrever um método de puriIcação de componentes orgânicos da polpa dos humanos e bovinos, vitales e necróticos para validar o modelo experimental bovino. Foram preparados extratos com 50 mg de fração média de polpas unirradiculares, 20 humanas ou 1 bovina em 500 µL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, fenil-metil-sulfonil Juoreto 1 mM e hidrocloreto de benzamidina 5 mM frio. Foi homogeneizado e centrifugado a 10.000 rpm. Os sobrenadantes foram parcialmente puriIcados com sulfatos de protamina 1%, os sedimentos ressuspensos e dialisados 2 horas com recâmbio em acetato de sódio 500 mM pH 6. Foram determinadas proteínas, hidroxiprolina e hidratos de carbono e se calculou o rendimento conforme o conteúdo de hidroxiprolina. Foi aplicada eletroforese em géis de poliacrilamida. Maior conteúdo orgânico foi encontrado em tecido humano que em bovino e em vital que em necrótico. Por hidroxiprolina/proteínas e rendimento, o extrato bovino conteria maior proporção de colágeno. Em polpas humanas foram obtidas faixas a 78 e 80 kDa e em bovinas a 74 e 76 kDa. Não houve diferenças entre tecido vital e necrótico. As evidências qualitativas e quantitativas expressas validariam o modelo bovino em pesquisas endodônticas.