Alkaline protease from a new halotolerant alkaliphilic Bacillus agaradhaerens strain ak-r isolated from egyptian soda lakes / Protease alcalina de uma nova estirpe ak-r halotolerante e alcalófila de Bacillus agaradhaerens isolada a partir dos lagos alcalinos egípcios

Alkaline proteases are hydrolytic enzymes that cleave peptide bonds in proteins and peptides in alkaline conditions, which occupy a pivotal importance with respect to their industrial applications. This study aimed to isolate new alkaline protease producing alkaliphilic bacteria from Egyptian soda lakes and optimize the fermentation process to enhance the enzyme production. The extensive screening process of the samples collected from Egyptian soda lakes resulted in isolation of a potent alkaline protease producing alkaliphilic strain AK-R. The isolate was identified as Bacillus agaradhaerens strain AK-R based on 16S rRNA gene analysis (99%). Wheat bran and gelatin supported maximum alkaline protease production as carbon and nitrogen sources, respectively. Strain AK-R is halo-tolerant thermotolerant alkaliphilic bacterium in nature, as it can grow over a wide range of NaCl concentrations (up to 25%) and up to 55 °C, with maximal growth and enzyme production at 2.5-5%, and pH 11 at 35 °C. Among the tested cations, only Mg2+ and Ca2+ ions significantly enhanced the enzyme production by about 1.2, and 1.3 fold compared to control, respectively. Alkaline protease secretion was coherent with the growth pattern, reaching maximal yield after about 32 h (mid stationary phase). In conclusion a new halo-tolerant thermo-tolerant alkaliphilic alkaline protease producing Bacillus agaradhaerens strain AK-R was isolated from Egyptian soda lakes. Optimization of the nutritional and cultivation conditions resulted in increase of enzyme yield by 20 fold. Strain AK-R and its extracellular alkaline protease with salt, pH and temperature, tolerance signify their potential application in laundry and pharmaceuticals industries.

Proteases alcalinas são enzimas hidrolíticas que quebram ligações peptídicas em proteínas e peptídeos em condições alcalinas, o que ocupa uma importância fundamental em relação às suas aplicações industriais. Este estudo teve como objetivo isolar novas proteases alcalinas e produzir bactérias alcalófilas a partir dos lagos salgados alcalinos egípcios e otimizar o processo de fermentação para aumentar a produção de enzimas. O extensivo processo de triagem das amostras coletadas dos lagos salgados alcalinos egípcios resultou no isolamento de uma protease alcalina potente produzindo uma estirpe alcalófila AK-R. O isolado foi identificado como sendo a estirpe AK-R de Bacillus agaradhaerens baseado na análise de genes 16S rRNA (99%). O farelo de trigo e a gelatina suportaram a produção máxima de protease alcalina como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente. A estirpe AK-R é uma bactéria alcalófila halotolerante e termotolerante, pois pode crescer dentro de uma vasta gama de concentrações de NaCl (até 25%) e até 55ºC, com crescimento e produção de enzimas máximos a 2.5-5% e pH 11 a 35ºC. Dentre os cátions testados, somente os íons Mg2+ e Ca2+ aumentaram significativamente a produção de enzimas em cerca de 1.2 e 1.3 em comparação ao controle, respectivamente. A secreção de protease alcalina foi coerente com o padrão de crescimento, atingindo o rendimento máximo após 32h (fase estacionária média). Pode-se concluir que uma nova estirpe AK-R de Bacillus agaradhaerens halotolerante, termotolerante e alcalófila produtora de protease alcalina foi isolada a partir dos lagos salgados alcalinos egípcios. A otimização das condições de nutrição e cultivo resultou num aumento da produção de enzima em 20 vezes. A estirpe AK-R e a sua protease alcalina extracelular com tolerância ao sal, pH e temperatura tornam significantes as suas potenciais aplicações nas indústrias farmacêutica e de lavanderia.

Ação de fatores enzimáticos na obtenção de hidrolisados protéicos de farinha de trigo com baixo teor de fenilalanina / Action of enzymatic factors in obtaining protein hydrolysates of wheat flour, low-phenylalanine

Visando ao preparo de farinha de trigo com baixo teor de fenilalanina (Phe), extraiu-se, enzimaticamente as proteínas, empregando-se uma protease alcalina de Bacillus licheniformis. Em seguida, os extratos protéicos foram hidrolisados pela ação de enzimas comerciais (pancreatina e bromelina) e de extratos enzimáticos obtidos da casca de abacaxi (bruto e purificado), avaliando-se alguns parâmetros enzimáticos, tais como tipo de enzima, tipo de ação enzimática, tipo de associação enzimática e ordem de ação enzimática. O carvão ativado (CA) foi empregado como meio adsorvente e a eficiência da remoção de Phe foi avaliada por espectrofotometria derivada segunda, determinando-se o teor de Phe na farinha de trigo e em seus hidrolisados, após tratamento com CA. O melhor resultado foi encontrado ao se empregar a associação sucessiva do extrato bruto seguida da pancreatina, tendo atingido 66,28 por cento de remoção e o teor final de Phe de 522,44 mg/100 g de hidrolisado.

With the aim of producing wheat flour with low phenylalanine (Phe) content to be introduced in phenylketonuric's diet, the proteins were enzymaticaly extracted, using an alkaline protease from Bacillus licheniformis. Then, the protein extracts were hydrolyzed by the action of commercial enzymes (pancreatin and bromelain) and of enzymatic extracts obtained from pineapple peel (crude and purified). Some enzymatic parameters were evaluated, such as type of enzyme, type of enzyme action, type of enzymatic association and order of enzyme action. The activated carbon (AC) was used as adsorbent and the efficiency of Phe removal was evaluated by second derivative spectrophotometry measuring the Phe content in wheat flour and in their hydrolysates after AC treatment. The best result was found for the successive association of crude extract followed by pancreatin obtaining 66.28 percent of removal and a final Phe content of 522.44 mg/100 g of hydrolysate.

Production of alkaline protease from Cellulosimicrobium cellulans / Produção de protease alcalina porCellulosimicrobium cellulans

Cellulosimicrobium cellulans is one of the microorganisms that produces a wide variety of yeast cell walldegradingenzymes, β-1,3-glucanase, protease and chitinase. Dried cells of Saccharomyces cerevisiae were used as carbon and nitrogen source for cell growth and protease production. The medium components KH2PO4, KOH and dried yeast cells showed a significant effect (p<0.05) on the factorial fractional design. A second design was prepared using two factors: pH and percentage of dried yeast cells. The results showedthat the culture medium for the maximum production of protease was 0.2 g/l of MgSO4.7H2O, 2.0 g/l of(NH4)2SO4 and 8% of dried yeast cells in 0.15M phosphate buffer at pH 8.0. The maximum alkaline protease production was 7.0 ± 0.27 U/ml over the center point. Crude protease showed best activity at 50ºC and pH 7.0-8.0, and was stable at 50ºC.

Cellulosimicrobium cellulans é um microrganismo que produz uma variedade de enzimas que hidrolisam a parede celular de leveduras: β-1,3-glucanase, protease e quitinase. Célulasdesidratadas de Saccharomyces cerevisiae foram usadas como fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento celular e produção de protease. Os componentes do meio de cultura: KH2PO4, KOH e células de levedura desidratadas mostraram efeitos significativos (p<0,05) no planejamento experimental fracionário. Um segundo planejamento foi preparado usandodois fatores: pH e porcentagem de células de levedura desidratadas. Os resultados mostraram que o meio de cultura para a produção máxima de protease foi 0,2 g/L de MgSO4.7H2O;2,0 g/L de (NH4)2SO4 e 8% de células de levedura desidratadas em tampão fosfato 0,15M e pH 8,0. A produção máxima de protease alcalina foi 7,0 ± 0,27 U/mL no ponto central. A proteasebruta apresentou atividade ótima a 50ºC e pH 7,0-8,0; e foi estável a 50ºC.

Secretion of an alkaline protease from a salt- tolerant and alkaliphilic, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1

An alkaliphilic and salt- tolerant actinomycete, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1, was isolated from Mithapur, the western coast of India. The organism was Gram-positive, having filamentous, long thread like structure. The sporulation started after two days of growth and the optimum level of alkaline protease (130 U/ml) was produced during the early stationary phase. The strain could grow and produce protease with 0-10 percent NaCl (w/v), the optimum being 5 percent NaCl (w/v). Growth and protease production was optimum at pH 9 with substantial decline at neutral pH. Sucrose and gelatin were the best carbon and nitrogen sources respectively, whereas gelatin broth was the preferred medium for protease production. Mit-1 produced substantial protease with various amino acids, when employed as the sole nitrogen sources. Crude substrates, such as molasses, whey and wheat flour had significant effect on enzyme production. The results are quite valuable, as only few actinomycetes, particularly salt-tolerant alkaliphilic ones, have so far been explored for their enzymatic potential and process optimization.

Uma cepa halotolerante e alcalifílica de Streptomyces clavuligerus, Mit-1, foi isolada em Mithapur, na costa oeste da Índia. Esse microrganismo é Gram positivo e apresenta estrutura filamentosa na forma de longas cordas. A esporulação iniciou após dois dias de cultivo e o nível ótimo de produção de protease alcalina (130 U/ml) foi atingido no início da fase estacionária de crescimento. A cepa foi capaz de multiplicar com 0-10 por cento NaCl (w/v), com um ótimo de 5 por cento NaCl (w/v). O ótimo de crescimento e produção de protease foi atingido em pH 9, apresentando declínio substancial em pH neutro. Sacarose e gelatina foram as melhores fones de carbono e nitrogênio, respectivamente, enquanto o caldo gelatina foi o melhor meio para produção de protease. A cepa Mit-1 produziu bastante protease quando vários aminoácidos foram empregados como única fonte de nitrogênio. Substratos crus, como melaço, soro de leite e farinha de trigo, tiveram um efeito significativo na produção da enzima. Os resultados são bastante interessantes, considerando que somente poucos actinomicetos, especialmente os halotolerantes, já foram explorados por seu potencial de produção de enzimas e otimização de processos.

Production of moderately halotolerant, SDS stable alkaline protease from Bacillus cereus MTCC 6840 isolated from lake Nainital, Uttaranchal state, India

A moderately cold active, extracellular alkaline protease producing bacterium was isolated from a fresh water lake. The isolate was found to be a gram-positive, rod shaped organism later identified as Bacillus cereus MTCC 6840. The bacterium produced the maximum amount of enzyme when allowed to grow for 24 h at temperature 25º and pH 9.0. Among a variety of substrates used, fructose as a carbon source and a combination of yeast extract and peptone as nitrogen source, supported the maximum protease production by the organism (120 U/ml). Fe++ and Co++ stimulated the enzyme activity whereas Ca++, Cu++, K+, Mg++ and Mn++ inhibited it to different extents. The protease was found to be highly stable in the presence of NaCl, SDS and acetone. Treatment with EDTA and PMSF resulted in the considerable loss of enzyme activity. The enzyme was found to be optimally active at pH 9.0 and temperature 20ºC.

Uma bactéria produtora de protease alcalina extracelular, moderadamente ativa no frio, foi isolada da água de um lago. Trata-se de um bacilo Gram positivo, identificado como Bacillus cereus MTCC6840. A maior produção da enzima foi em 24h a 25ºC e pH 9,0. A produção máxima de protease (120 U/ml) ocorreu quando foi utilizada frutose como fonte de carbono e uma combinação de extrato de levedura com peptona como fonte de nitrogênio. Fe++ e Co++ estimularam a atividade da enzima, enquanto Ca++, Cu++, K+,Mg++ e Mn++ tiveram efeito inibitório, com intensidades diferentes. A protease permaneceu estável na presença de NaCl, SDS e acetona. O tratamento com EDTA e PMSF causou uma significativa perda na atividade. A enzima apresentou atividade ótima em pH 9,0 e temperatura de 20ºC.