Aislamiento enzimático de protoplastos a partir del mesófilo de vitroplantas de Gynerium sagittatum Aubl. Beauv. cv. "Criolla"

Gynerium sagittatum es una gramínea ampliamente utilizada en la costa Caribe colombiana como fuente de fibra natural para la elaboración de artesanías, particularmente por la comunidad Zenú. En la presente investigación se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de enzimas: celulasa y macerozima a diferentes tiempos de incubación y sus interacciones en el aislamiento de protoplastos. Los protoplastos se obtuvieron del mesófilo foliar de vitroplantas de G. sagittatum expuesto a combinaciones enzimáticas de celulasa (1.5 y 2.0%), con macerozima (0.3, 0.6 y 0.9%), durante 3, 6 y 9 horas de incubación, para un total de 18 tratamientos con 5 réplicas cada uno. Los mayores números de protoplastos aislados correspondieron a T18 (2.0% celulasa, 0.9% macerozima), T12 (2.0% de celulasa, 0.3% macerozima), T3 (1.5% de celulasa, 0.3% de macerozima) y T6 (1.5% de celulasa, 0.6% de macerozima) por 9 horas de incubación cada uno, con valores de 88.625, 83.000, 75.000 y 53.375 protoplastos/mL respectivamente. El tiempo de incubación fue significativo en el aislamiento de los protoplastos (p<0.05). Las predicciones entre factores mostraron que una interacción de 2.0% de celulasa y 0.9% de macerozima permite obtener 44.302 protoplastos/mL, mientras que las interaciciones tiempo de incubación-celulasa y tiempo de incubación-macerozima mostraron que es posible obtener 72.073 y 71.212 protoplastos/mL con 2.0% de celulasa y 0.9% macerozima por 9 horas de incubación cada una respectivamente. Los resultados indican que la aplicación de estas enzimas permite obtener cantidades considerables de protoplastos de G. sagittatum a partir de explantes cultivados in vitro.

Gynerium sagittatum is a graminaceous plant widely used in the Caribbean coast of Colombia as a natural fiber source for the elaboration of handicrafts, particularly by the Zenú community. In the present investigation, the effect of different concentrations of cellulase and macerozyme enzymes at different incubation times and their interaction in the isolation of protoplasts was evaluated. Protoplasts were obtained from leaf mesophyll of G. sagittatum vitroplants exposed to enzymatic combinations of cellulase (1.5 and 2.0%), with macerozyme (0.3, 0.6 and 0.9%), for 3, 6 and 9 hours of incubation, for a total of 18 treatments with 5 replicates each. The highest numbers of isolated protoplasts corresponded to T18 (2.0% cellulase, 0.9% macerozyme), T12 (2.0% cellulase, 0.3% macerozyme), T3 (1.5% cellulase, 0.3% macerozyme) and T6 (1.5% cellulase, 0.6% macerozyme); at 9 hours incubation. The protoplast number for these treatments were: 88.625, 83.000, 75.000 and 53.375 protoplasts/mL respectively. Incubation time was significant in the isolation of protoplasts (p<0.05). The predictions between the factors showed that with an interaction of 2.0% cellulase and 0.9% macerozyme it is possible to obtain 44.302 protoplasts/mL, likewise, the incubation time-cellulase and incubation time-macerozyme interactions showed that it is possible to obtain 72.073 and 71.212 protoplasts/mL with 2.0% cellulase and 0.9% macerozyme for 9 hours of incubation respectively. The results indicate that the use of these enzymes and time, allows the isolation of of protoplasts from G. sagittatum in vitro plants.

Microalgae protoplasts isolation and fusion for biotechnology research / Aislamiento y fusión de protoplastos de microalgas para aplicaciones biotecnológicas

ABSTRACT Protoplasts are microbial or vegetable cells lacking a cell wall. These can be obtained from microalgae by an enzymatic hydrolysis process in the presence of an osmotic stabilizer. In general, protoplasts are experimentally useful in physiological, genetic and biochemical studies, so their acquisition and fusion will continue to be an active research area in modern biotechnology. The fusion of protoplasts in microalgae constitutes a tool for strain improvement because it allows both intra and interspecific genetic recombination, resulting in organisms with new or improved characteristics of industrial interest. In this review we briefly describe the methodology for obtaining protoplasts, as well as fusion methods and the main applications of microalgal platforms.

RESUMEN Los protoplastos son células microbianas o vegetales que carecen de pared celular. Estos pueden obtenerse a partir de microalgas por un proceso de hidrólisis enzimática en presencia de un estabilizador osmótico. En general, los protoplastos son experimentalmente útiles en estudios fisiológicos, genéticos y bioquímicos, por lo que su obtención y fusión continuarán siendo un área de investigación activa en la biotecnología moderna. La fusión de protoplastos en microalgas constituye una herramienta para el mejoramiento de cepas pues permite la recombinación genética intra e interespecífica, logrando así organismos con nuevas características de interés industrial. En esta revisión, describimos brevemente la metodología para obtener protoplastos, métodos de fusión y las principales aplicaciones de las plataformas basadas en microalgas.

Fusión intergénica de protoplastos de Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora guillermondii / Intergenic fusion of Saccharomyces cerevisiae and Hanseniaspora guillermondii protoplasts

La fusión de protoplastos ha facilitado la obtención de nuevas cepas de levaduras con propiedades biotecnológicas muy interesantes. El principal objetivo de esta investigación fue obtener una levadura híbrida intergénica con potencialidades enológicas características de dos géneros diferentes. Para ello se fusionaron protoplastos de Saccharomyces cerevisiae autóctona de la región zuliana con Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 de origen comercial. Saccharomyces es una levadura que produce altas concentraciones de etanol pero el perfil aromático es sencillo y común. Hanseniaspora no resiste las concentraciones de etanol, pero puede generar aromas agradables e intensos. La identificación de las levaduras antes y después de la fusión de protoplastos se realizó con la técnica PCR-RFLP del gen 5.8S rADN y las regiones intergénicas adyacentes ITS1 e ITS2 del ADN extraído, sometiendo los productos amplificados a un análisis de restricción con las enzimas HinfI, HaeIII, CfoI y DdeI. El polietilenglicol fue usado para inducir la fusión de protoplastos. La cepa híbrida presentó características de ambas levaduras parentales debido a que resistió altas concentraciones de etanol como S. cerevisiae y fue capaz de metabolizar el salicín como H. guillermondii. El análisis molecular PCR-RFLP de la levadura híbrida mostró un patrón de bandas diferente al de las levaduras parentales.

Protoplast fusion has facilitated the development of new yeast strains with very interesting biotechnological properties. The main objective of this research was to obtain hybrid yeast with potentialities of two different genera, that could be used in the wine manufacture. Saccharomyces cerevisiae protoplasts from the Zulian region were fused with Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 of commercial origin. Saccharomyces is a yeast that produces high levels of ethanol but the aromatic profile is simple and common. Hanseniaspora does not withstand ethanol concentrations, but it can generate pleasant and intense aromas. Identification of yeast before and after the fusion of protoplasts was performed using the PCR-RFLP technique of the 5.8S rDNA gene and the adjacent ITS1 and ITS2 intergenic regions of the extracted DNA, subjecting the amplified products to a restriction with the enzymes HinfI, HaeIII, CfoI and DdeI. Polyethylene glycol was used to induce fusion of protoplasts. The hybrid strain showed characteristics of both parental yeasts because it resisted high concentrations of ethanol as S. cerevisiae and was able to metabolize the salicin as H. guillermondii. PCR-RFLP molecular analysis of hybrid yeast showed a different band pattern than those pertaining to parental yeasts.

Efecto de cobre y Paraquat® sobre respuestas asociadas a estrés oxidativo en dos especies relacionadas de tomate / Effect of copper and Paraquat® on responses associated to oxidative stress in two related species of tomato

Introducción: la capacidad antioxidante presente en las plantas ha despertado gran interés debido al potencial aprovechamiento en la alimentación para la prevención de enfermedades asociadas a estrés oxidativo. Objetivo: evaluar el efecto de la inducción con CuCl2 y Paraquat® (dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridilo) sobre protoplastos y plántulas de las especies relacionadas de tomate, Lycopersicon hirsutum Dunal y Lycopersicon esculentum Mill. Métodos: la producción de especies reactivas de oxígeno se evaluó mediante citometría de flujo en protoplastos de las 2 especies de tomate, inducidos con CuCl2 y Paraquat® (dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridilo). Adicionalmente, sobre las plántulas se evaluó el contenido de polifenoles totales y la capacidad atrapadora de radicales libres. Resultados: la inducción con Paraquat® durante eventos tempranos mostró un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno en 17,4 veces en protoplastos de Lycopersicon hirsutum y de 12,4 veces en Lycopersicon esculentum con respecto a sus respectivos controles no tratados. La especie Lycopersicon esculentum presentó velocidades de producción significativas de contenido de polifenoles totales y capacidad atrapadora de radicales libres con valores de 1,81 Eq ácido gálico hora-1 y 5,3 % de decoloración del DPPH hora-1, respectivamente. Durante la inducción con Paraquat® se observó una correlación entre contenido de polifenoles totales y capacidad atrapadora de radicales libres cercana a 1 y altamente significativa, en respuesta a los 2 tipos de inducción durante los eventos tempranos. Conclusiones: los resultados sugieren que la biosíntesis de compuestos fenólicos y la correlación con la capacidad atrapadora de radicales libres, no necesariamente se encuentra relacionada con una actividad antioxidante como un mecanismo de defensa a nivel celular.

Introduction: the antioxidant capacity in plants has aroused great interest due to their potential use in food for the prevention of oxidative stress-associated diseases. Objectives: to evaluate the effect of CuCl2 and Paraquat® induction on protoplasts and tomato seedlings belonging to Lycopersicon hirsutum Dunal and Lycopersicon esculentum Mill. species. Methods: the production of reactive oxygen species in protoplasts of tomato both species after exposure to CuCl2 and Paraquat® (1.1'-dimethyl-4.4'-bipiridyl dichloride) was evaluated by flow cytometry. Tomato seedlings were evaluated for total polyphenol content and free radical scavenging. Results: Paraquat® induction showed a 17.4 fold increase in reactive oxygen species production for L. hirsutum protoplasts and a 12.4 fold for L. esculentum during early events with respect to their respective untreated controls. L. esculentum showed significant slopes for free radical scavenging and total polyphenol content: 1.81 galic acid eq per hour and 5.3 % DPPH discoloration per hour, respectively. In addition, in response to the two kinds of induction, positive slopes and a correlation between total polyphenol content and free radical scavenging were observed with copper induction (correlation close to 1 and highly significant), but not significant models during Paraquat® induction. Conclusions: these results suggest that the biosynthesis of phenolic compounds and the correlation with the free radical scavenging are not necessarily related to antioxidant activity as a cellular defense mechanism.

Produção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides em diferentes condições de cultivo / Production and regeneration of protoplasts from Colletotrichum gloeosporioides in different conditions

A obtenção de protoplastos de fungos, utilizando-se enzimas degradadoras de parede celular, tem sido o método mais utilizado em processos de transformação genética. Foram testados dois tipos de estruturas fúngicas (micélio e conídios), diferentes concentrações enzimáticas (5, 10, 20 mg), estabilizadores osmóticos (NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L-1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L-1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; SorbitoL 0,6 mol.L-1 pH 5,7) e seis tempos de exposição dos protoplastos ao sistema lítico, para estabelecer condições otimizadas de obtenção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides, agente relacionado a mancha manteigosa em cafeeiros. Protoplastos de C. gloeosporiodes foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi exposto durante 4 horas, com 10 mg.mL-1 de Lysing Enzime em KCl 0,7 mol.L-1 que se apresentou como melhor estabilizador osmótico, com frequência de regeneração de 11,64%.

The isolation and regeneration of protoplasts from fungal cells, using several cell wall degrading enzymes, has been the most common method to prepare competent cells for genetic studies of filamentous fungi. In this work two types of fungal structures, different enzyme concentrations (5, 10, 20 mg), osmotic stabilizers (NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L-1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L-1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; Sorbitol 0,6 mol.L-1 pH 5,7), and six exposure times to establish optimum conditions of isolation and regeneration of protoplasts of Colletotrichum gloeosporioides, agent of blister spot on coffee, were tested. Protoplast of C. gloeosporioides were obtained in greater quantities when the mycelium was exposed for 5 hours with 15mg.mL-1 of Lysing Enzyme in 0.7 mol.L -1 of KCl as osmotic stabilizer, presenting a regeneration rate of 11.64%.

Factors affecting the production and regeneration of protoplasts from Colletotrichum lindemuthianum / Fatores que afetam a produção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum lindemuthianum

The present work reports factors affecting the production and regeneration of protoplasts from Colletotrichum lindemuthianum. The usefulness of protoplast isolation is relevant for many different applications and has been principally used in procedures involving genetic manipulation. Osmotic stabilizers, lytic enzymes, incubation time and mycelial age were evaluated in terms of their effects on protoplast yield. The optimal condition for protoplast production included the incubation of young mycelia (48 h) in 0.6 mol l-1 NaCl as the osmotic stabilizer, with 30 mg ml-1 Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum for 3 h of incubation. In these conditions protoplasts production was higher than 10(6) protoplatos ml-1 in the digestion mixture, number suitable enough for experiments of transformation in fungi. Sucrose concentrations of 1.2 mol l-1 and 1 mol l-1 were the most suitable osmotic stabilizers for the regeneration after 48 h, with rates of 16.35 percent and 14.54 percent, respectively. This study produced an efficient method for protoplast production and reverted them into a typical mycelial morphology using a Colletotrichum lindemuthianum LV115 isolate.

O presente trabalho apresenta os fatores que afetam a produção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum lindemuthianum. O isolamento de protoplastos é muito relevante para diferentes aplicações, principalmente, em procedimentos que envolvem a manipulação genética. Estabilizadores osmóticos, enzimas líticas, tempo de incubação e idade micelial foram testados com relação ao efeito na liberação de protoplastos. As condições otimizadas para produção de protoplastos foram incubação de micélio jovem (48 h) em estabilizador osmótico NaCl 0.6 mol l-1, acrescido de 30 mg ml-1 da enzima Lysing Enzymes de Trichoderma harzianum incubado, durante 3 h. Nessas condições, a obtenção de protoplastos foi maior que 10(6) protoplatos ml-1 na mistura de digestão, número suficientemente adequado para experimentos de transformação em fungos. Sacarose nas concentrações de 1.2 mol l-1 e 1 mol l-1 foram os estabilizadores mais apropriados para a regeneração, após 48 h, sendo as taxas de regeneração de 16.35 por cento e 14.54 por cento, respectivamente. Este estudo produziu um método eficiente para produção e reversão de protoplastos à morfologia micelial típica de Colletotrichum lindemuthianum utilizando o isolado LV115.

Production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans 191 / Produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular de Cellulosimicrobium cellulans 191

This study concerned the production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans strain 191. In shaken flasks the maximum yield of chitinase was 6.9 U/mL after 72 h of cultivation at 25ºC and 200 rpm. In a 5 L fermenter with 1.5 vvm aeration, the highest yield obtained was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation at 25ºC and 200 rpm, and using 3 vvm, it was 4.38 U/mL after 144 h of fermentation. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times by Sepharose CL 4B 200 gel filtration with a yield of 46.61 percent. The purified enzyme was able to lyse the cell walls of some fungi and to form protoplasts.

O presente estudo visou a produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191. A maior produção de quitinase em frascos agitados foi 6,9 U/mL após 72 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm. Em fermentador de 5 L utilizando aeração de 1,5 vvm, a maior atividade da enzima foi 4,19 U/mL após 168 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm; e com 3 vvm, foi obtido 4,38 U/mL após 144 h de fermentação. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes em coluna de filtração em gel Sepharose CL 4B 200 com um rendimento de 46,61 por cento. A enzima purificada foi capaz de lisar a parede celular de alguns fungos e formar protoplastos.

Obtenção de protoplastos do fungo filamentoso Aspergillus ochraceus / Production of protoplasts from the filamentous fungus Aspergillus ochraceus

A obtenção de protoplastos é uma ferramenta importante para a transformação genética de fungos. Neste trabalho foi estudada a influência de fatores como idade micelial, tipo e concentração de enzimas e estabilizadores osmóticos na produção de protoplastos de Aspergillus ochraceus. Os melhores resultados de produção de protoplastos foram obtidos utilizando-se NH4Cl 0,8mol L-1 como estabilizador osmótico, micélio com 24h de crescimento e a combinação de Lysing Enzymes e Meicelase ambas, a 20mg mL-1. Entretanto, bons resultados foram também obtidos com a utilização apenas de Lysing Enzymes.

Production of protoplasts is an important tool for genetic transformation of fungi. A protocol for protoplasts production in Aspergillus ochraceus was developed, evaluating culture aging of mycelium, different commercial enzymes and osmotic stabilizers. The best results were obtained with NH4Cl 0.8mol L-1 as osmotic stabilizer, mycelial age of 24 hours and Lysing Enzymes (20mg mL-1) plus Meicelase (20mg mL-1) as lytic enzymes. Good results were also obtained with Lysing Enzymes alone.