ABSTRACT
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma de demencia más común en la edad adulta. Se manifiesta con la pérdida progresiva de la memoria a medida que las neuronas en la corteza cerebral y el hipocampo mueren. En todas las formas de EA se evidencia aumento de la expresión de diferentes proteínas, así como la presencia de agregados insolubles de péptido-β-amiloide (PBA). La glutamina sintetasa (GS) es una enzima clave en el metabolismo del glutamato y en la detoxificación de amonio (NH4+). Previamente se ha reportado una posible interacción GS-PBA que puede estar asociada con EA. En este trabajo se realizó la purificación de la enzima cerebral de rata a partir de un extracto sometido a precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 del 20-60 % de saturación y posteriormente a través de cromatografías sucesivas de filtración en gel, intercambio iónico y afinidad. El peso molecular del complejo fue calculado en 137 kDa por el orden de elución en la columna de filtración. Se identificó interacción de la enzima con PBA 1-40, lográndose la purificación de una sola banda de 45 kDa, correspondiente a la forma monomérica de la GS. En este trabajo se presenta un nuevo método de purificación de la enzima y se demuestra la interacción de GS con el PBA. Se propone que esta interacción GS-PBA puede ser uno de los procesos que se presentan en la enfermedad al explicar la reducción de la actividad de la enzima en paciente con EA, ya que podría alterar el ciclo glutamato-glutamina y generar cambios en el entorno celular que favorecen excitotoxicidad por glutamato típica de los procesos de neurodegeneración.
Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia in adulthood; it is manifested by the progressive loss of memory since neurons in both cerebral cortex and hippocampus die. In all the forms of AD is observed the increased expression of different proteins, as well as the presence of insoluble aggregates of β-amyloid peptide (BAP). Glutamine synthetase (GS) is a key enzyme in the metabolism of glutamate and in the detoxification of ammonium (NH4+). A possible interaction GS-PBA has been previously reported and it can be associated with AD. In this work we performed the purification of the enzyme from rat brain extract subjected to fractional precipitation 20-60 % saturation with (NH4)2SO4, and thereafter through successive chromatographies of gel filtration, ion exchange and affinity. The molecular weight of the complex was calculated at 137 kDa by the order of elution in the column filtration. The interaction of the enzyme with 1-40 PBA was identified, achieving the purification of a single band of 45 kDa corresponding to the monomeric form of the GS. In this paper we present a new method of the enzyme purification and we demonstrated the interaction of GS with the PBA. We propose this interaction GS-PBA can be one of the processes that occur in the disease and it could explain the reduction in enzyme activity in patients with AD, since it might alter the glutamate-glutamine cycle and generate changes in the cellular environment which favor glutamate excitotoxicity typical of neurodegeneration processes.
A doença do Alzhéimer (DA) é a forma mais comum de demência na idade adulta, que se manifesta pela perda progressiva da memória, já que os neurónios em córtex cerebral e hipocampo morrem. Em todas as formas de AD é observado o aumento da expressão de proteínas diferentes, bem como a presença de agregados insolúveis de β-amilóide péptido (BAP). Glutamina sintetase (GS) é uma enzima chave no metabolismo do glutamato e na desintoxicação de amónio (NH4+). Uma possível interacção GS-PBA foi relatada anteriormente e pode ser associada com o AD. Neste trabalho, foi realizada a purificação da enzima a partir do extrato do cérebro de rato e foi submetido a precipitação fraccionada com (NH4)2SO4 de 20- 60 % de saturação e, subsequentemente, através de cromatografias sucessivas de filtração em em gel, permuta iónica e de afinidade. O peso molecular do complexo foi calculado em 137 kDa por ordem de eluição na filtração de coluna. A interacção da enzima com 1-40 PBA foi identificada, alcançando a purificação de uma única banda de 45 kDa correspondente à forma monomérica do GS. Neste artigo, apresentamos um novo método de purificação da enzima e demonstramos a interação da GS com o PBA. Propomos que esta interacção GS-PBA pode ser um dos processos que ocorrem na doença e pode explicar a redução na actividade da enzima nos pacientes com o AD, uma vez que poderia alterar o ciclo de glutamatoglutamina e gerar alterações no ambiente celular que favorecem a excitotoxicidade típica do glutamato nos processos de neurodegeneração.
ABSTRACT
Every day, new proteins are discovered and the need to understand its function arises. Human proteins have a special interest, because to know its role in the cell may lead to the design of a cure for a disease. In order to obtain such information, we need enough protein with a high degree of purity, and in the case of the human proteins, it is almost impossible to achieve this by working on human tissues. For that reason, the use of expression systems is needed. Bacteria, yeast, animals and plants have been genetically modified to produce proteins from different species. Even "cell-free" systems have been developed for that purpose. Here, we briefly review the options with their advantages and drawback, and the purification systems and analysis that can be done to gain understanding on the function and structure of the protein of interest.
Cada día, nuevas proteínas son descubiertas y surge la necesidad de caracterizarlas, siendo las de origen humano las que presentan un mayor interés. Conocer su función nos ayudará a entender padecimientos y diseñar una posible cura. Sin embargo, obtener suficiente cantidad de proteínas humanas en cantidad para llevar a cabo los análisis pertinentes, presenta una gran dificultad. Por tal razón, es necesario el uso de sistemas de expresión de proteínas heterólogas. Bacterias, levaduras, animales y plantas han sido modificados genéticamente para expresar proteínas de otras especies, e incluso sistemas in vitro han sido desarrollados para producir proteínas. En este artículo se revisan brevemente las opciones con sus ventajas y desventajas, así como las estrategias de purificación y los análisis que se pueden llevar a cabo para avanzar en el conocimiento de la función y estructura de la proteína de interés.