Presencia de genes rhlAB, rhlR y rhlC en Pseudomonas aeruginosa nativas sobreproductoras de ramnolípidos

Se realizó la caracterización molecular de los genes asociados a la producción de ramnolípidos (RL), en 61 cepas bacterianas de la colección del Laboratorio de Microbiología y Biotecnología Microbiana (LAMYBIM) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú. Las cepas provenian de entornos peruanos contaminados con hidrocarburos y fueron catalogadas como sobreproductoras de RL(n= 21), productoras de RL (n=20) y no productoras de RL (n= 20). Las 61 cepas fueron identificadas bioquímicamente con el sistema API 20 NE. La identificación molecular se realizó empleando el gen del RNAr 16S. Se encontró que Pseudomonas aeruginosa fue el microorganismo de mayor prevalencia en los estratos sobreproductores y productores de ramnolípidos. Además, se encontraron: Burkholderia cepacea, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila y Chryseobacterium indologenes. Los microorganismos no productores de ramnolípidos, también fueron caracterizados bioquímicamente. Mediante amplificación de PCR y electroforesis en gel de agarosa, estandarizados por la UNAM, se evidenció que las cepas seleccionadas poseen los genes: rhlA, rhlB, rhlR y rhlC. Para el secuenciamiento de la región génica rhLABR, se seleccionaron cuatros especies: Pseudomonas aeruginosa T2X-2, Pseudomonas aeruginosa IIIT1P2, Pseudomonas aeruginosa 6K-11 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, siguiendo metodología estandarizada por la UNAM y fueron comparados con Pseudomonas aeruginosa PAO1. Nuestros resultados muestran que los genes estudiados en las cepas seleccionadas son sinónimas de sus homólogos en la cepa patrón Pseudomonas aeruginosa PAO1, por lo que las diferencias genotípicas que expliquen la sobreproducción de ramnolípidos deberían hallarse en otros marcadores moleculares no cubiertos en el presente estudio.

Genes associated to rhamnolipids production were molecularly characterized in 61 bacterial strains from LAMYBIM bacterial collection (Laboratorio de Microbiología y Biotecnología Microbiana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú). Strains were isolated from peruvian environments hydrocarbons polluted and were classified as RL overproducers (n= 21), RL producers (n = 20) and non-producers (n = 20) producers. Molecular identification using the 16S rRNA gene was preceded by the biochemical identification of 61 strains selected with the API 20 NE system. Pseudomonas aeruginosa was the most prevalent strain of the RL overproducers and RL producers. Species such as Burkholderia cepacea, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila and Chryseobacterium indologenes, were found too. In the same way, non-producers microorganisms were also characterized. The PCR amplification and agarose gel electrophoresis techniques, standarized by the UNAM laboratory, showed that the selected strains had the genes: rhlA, rhlB, rhlR and rhlC. For the sequencing of the rhLABR gene region, four strains were selected: Pseudomonas aeruginosa T2K2, Pseudomonas aeruginosa III T1P2, Pseudomonas aeruginosa 6K-11 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, applying the methodology standardized by the UNAM and were compared with Pseudomonas aeruginosa PAO1. Our results show that the genes studied in the selected strains are synonymous with their homologues in Pseudomonas aeruginosa PAO1 standard strain. Therefore, genotypical differences that explain the overproduction of rhamnolipid might be found in other molecular markers not covered in this study.

Optimización y modificación del método para la detección de ramnolípidos

El uso de biosurfactantes en biorremediación facilita y acelera la degradación microbiana de hidrocarburos. El método del agar CTAB/MB creado por Siegmund y Wagner para el screening de cepas productoras de ramnolípidos (RL), ha sido ampliamente utilizado sin sufrir mejoras significativas en más de 20 años. Con el fin de optimizar la técnica como método cuantitativo, se hicieron placas con agar CTAB/MB y se probaron diferentes variables, tales como tiempo de incubación, refrigeración, concentración de CTAB, presencia de azul de metileno, diámetro de los pozos y volumen del inóculo. Adicionalmente, se desarrolló un nuevo método para detectar el RL de los halos mediante precipitación con HCl, lo cual permite la observación de un nuevo patrón de halos más fáciles de observar y medir. Esta investigación reafirma que este método no es del todo apropiado para un análisis cuantitativo fino, debido a la dificultad de correlacionar de forma precisa la concentración de RL y el área de los halos formados. La difusión del RL no parece tener un comportamiento simple y existen numerosos factores que afectan la velocidad de migración del RL.

Use of biosurfactants in bioremediation, facilitates and accelerates microbial degradation of hydrocarbons. CTAB/MB agar method created by Siegmund & Wagner for screening of rhamnolipids (RL) producing strains, has been widely used but has not improved significantly for more than 20 years. To optimize the technique as a quantitative method, CTAB/MB agar plates were made and different variables were tested, like incubation time, cooling, CTAB concentration, methylene blue presence, wells diameter and inocula volume. Furthermore, a new method for RL detection within halos was developed: precipitation of RL with HCl, allows the formation a new halos pattern, easier to observe and to measure. This research reaffirm that this method is not totally suitable for a fine quantitative analysis, because of the difficulty to accurately correlate RL concentration and the area of the halos. RL diffusion does not seem to have a simple behavior and there are a lot of factors that affect RL migration rate.