Genetic transformation of the Brazilian BR 451 maize variety by the Agrobacterium tumefaciens method / Transformação genética da variedade brasileira de milho BR 451 pelo método da Agrobacterium tumefaciens

ABSTRACT: The asexually gene introduction by genetic engineering has brought enormous possibilities to innovate plant breeding. However, principally because of the low in vitro response, genetic transformation has been restricted to only certain genotypes of agronomically significant species. With the objective of establishing a protocol for genetically transforming the Brazilian BR 451 maize variety through Agrobacterium tumefaciens, it was studied the capacity of plant regeneration in vitro from embryogenic calli cultivated in three regeneration media, each having different growth regulators. It was also evaluated the temperature stress effect on the transformation of the immature embryos with A. tumefaciens EHA 101 containing the plasmid pTF102 with uidA and bar genes. The BR 451 variety embryos and those of the Hi-II hybrid (control) were exposed to three treatments applied as they were being infected with the agrobacteria (a) infection at 25°C; (b) infection at 40°C; (c) pretreatment at 40°C for 5 seconds followed by infection at 25°C. Transformation was determined by uidA gene expression and through the callus resistant to the herbicide Bialaphos® formation. Embryos infected at 40°C showed a higher degree of genetic transformation in the Hi-II, although the same was not noted in BR 451. When growth regulators were added to the culture medium the number of regenerated BR 451 plants showed no increase.

RESUMO: A introdução de genes de forma assexual por meio da engenharia genética tem ampliado as possibilidades do melhoramento genético vegetal. No entanto, devido principalmente a baixa resposta in vitro, a transformação genética tem se limitado a poucos genótipos das espécies de interesse agronômico. Visando estabelecer protocolo de transformação genética da variedade de milho BR 451 via Agrobacterium tumefaciens, foi estudada a capacidade de regeneração de plantas in vitro a partir de calos embriogênicos cultivados em três meios de regeneração contendo diferentes reguladores de crescimento. Também foi avaliado o efeito do estresse de temperatura na transformação de embriões imaturos com a A. tumefaciens EHA 101portadora do plasmídeo pTF102 que contém os genes uidA e bar. Para tal, três tratamentos foram aplicados aos embriões da variedade BR 451 e do híbrido Hi-II (controle) durante a infecção com a agrobactéria: (a) infecção em 25oC; (b) infecção a 40oC; (c) pré-tratamento de 40oC por cinco segundos seguido por infecção em 25oC. A transformação foi avaliada mediante a expressão do gene uidA e a formação de calos resistentes ao herbicida Bialaphos®. A infecção de embriões a 40oC aumentou a transformação genética em Hi-II, mas não em BR 451. A adição de reguladores de crescimento no meio de regeneração não incrementou o número de plantas regeneradas.

Morphogenesis in vitro of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora tzelev) from stem and pedicel explants / Morfogênese in vitro de crisântemo (Dendranthema grandiflora tzelev) a partir de explantes de caule e pedicelo

Visando a adequação de um protocolo de morfogênese in vitro para plantas de crisântemo (Dendranthema grandiflora Tzelev) analisou-se três fatores que afetam a frequência da regeneração. Foram avaliadas três concentrações de ácido indolil-acético (AIA) e 6- Benzilaminopurina (BAP), a fonte de explante (caule e pedicelo) e a orientação de inoculação do explante no meio de cultivo. Ao final de 15-30 dias de cultivo, observou-se que a fonte de explante, o tipo de explante e a interação explante e meio de cultivo afetaram significativamente a frequência de regeneração (FR) e o número de ramos por explantes (NRE) em crisântemo. Os explantes de pedicelo apresentaram maiores frequências de regeneração (15-20 dias) em meio de cultivo suplementado com 0,5 mg L-1 de BAP e 2,0 mg L-1 de AIA e os explantes caulinares (30 dias) em meio com 2,0 mg L-1 de BAP e 0,5 mg L-1 de AIA. Respostas diferenciais em relação à morfogênese foram observadas quando as duas posições do pedicelo foram inoculadas no meio de cultivo, a região seccionada em contato com o meio de cultivo suplementado com 0,5 mg L-1 de BAP e 2,0 mg L-1 de AIA proporcionou maior frequência de brotos. Foram obtidas plantas com flores 45-60 dias após a transferência para a casa de vegetação. As flores apresentavam os mesmos padrões e características das flores das plantas doadoras de explantes. Podese concluir que a o tipo de explante, sua orientação em relação ao meio de cultura bem como as combinações de reguladores de crescimento são fatores-chave envolvidos no sucesso da regeneração de plantas de crisântemo in vitro.

Aiming the optimization of a regeneration protocol for chrysanthemum plants (Dendranthema grandiflora), experiments of regeneration in vitro were accomplished, stem explants and pedicel inoculated in several shoots induction mediuns. The stem explants and of pedicels they were sectioned longitudinally and inoculated with the face opposed to the section in the medium of cultivation with the basic salts MS, with different concentrations and combinations of growth regulators BAP and AIA. At the end of 15-30 days of cultivation, significant differences were observed in the regeneration frequency, number of shoots for explante and in the length of the shoots among the appraised explantes. Explants of pedicel presented potential the best to the explants stem. The pedicel explants presented larger regeneration frequencies in medium of cultivation contends basic salts of MS, with 0,5 mg L-1 of BAP and 2,0 mg L-1 of AIA and the explantes of stem in medium with basic salts of MS + 2,0 mg L-1 of BAP and 0,5 mg L-1 of AIA. They were obtained plants with flowers 45-60 days after the transfer to the vegetation house. In function of the obtained results, it can be concluded that the choice of the explant type and the medium of cultivation are factor-key involved in the success of the regeneration of plants for posterior use in experiments of genetic transformation.

Cultivo in vitro de Brosimum gaudichaudii Tréc. (Moraceae) / In vitro cultivation of Brosimum gaudichaudii Tréc. (Moraceae)

O objetivo desta pesquisa foi avaliar o potencial organogenético de entrenós, discos foliares, e raízes de Brosimum gaudichaudii utilizando 12 diferentes combinações dos fitorreguladores 6-benzilaminopurina e ácido naftaleno acético, em meio MS (diluído à metade), sólido (6,5 g de ágar), e com 20 g.L-1 de sacarose. Independentemente das combinações hormonais testadas verificou-se a formação de calos friáveis (2 a 20 mm de diâmetro) em 90% dos entrenós usados como explantes. No entanto, os tratamentos testados não foram capazes induzir calos ou gemas em raízes e em discos foliares. O estudo anatômico revelou a formação de meristemóides nas regiões mais externa e mais interna dos calos. Os resultados obtidos poderão servir de base para novos testes de indução de calos na espécie.

The objective of this research was to evaluate the organogenic potential of internodes, leaf discs and roots of Brosimum gaudichaudii using 12 different combinations of the plant growth regulators 6-benzylaminopurine and naphthalene acetic acid in MS medium (half strength), solid medium (6.5 g agar) and sucrose medium (20 g.L-1). Regardless the hormonal combination tested, we observed the formation of friable calluses (2 - 20 mm wide) in 90% of the internode explants. However, the treatments were not able to induce callus or buds on roots and leaf discs. The anatomical analysis revealed meristemoid formation in the outer and inner regions of the calluses. The results may serve as the basis for further testing of callus induction in this species.

Efeito de diferentes reguladores de crescimento na regeneração in vitro de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) / Effect of differents growth regulators in vitro propagation of Aniba rosaeodora Ducke

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para a regeneração in vitro de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke), utilizando brotações apicais e segmentos nodais inoculados em meio de cultura com distintas concentrações de diferentes reguladores de crescimento. Explantes esterilizados com soluções de benomyl (4,0 g.L-1) por 24 horas e hipoclorito de sódio a 20% + tween 20 por 20 minutos, foram submetidos a um experimento de indução de broto, raiz e calo em meio MS1 acrescido de 30g.L-1 de sacarose e 9g.L-1 de agar, suplementado com BAP (0,0 e 4,0 mg.L-1), ANA, AIA e 2,4-D (0,0; 3,0 e 6,0 mg.L-1), e suas respectivas combinações. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 7 X 2, com 14 tratamentos e 15 repetições cada, onde foram analisados o número médio de brotos, raízes e calo. Após 90 dias, os resultados mostraram que a presença de auxinas é fundamental para a formação dos parâmetros induzidos nos explantes de pau-rosa. O meio de cultura contendo 4,0 mg.L-1 de BAP + 6,0 mg.L-1 de AIA apresentou a melhor média para a brotação com 2,13 brotos/explante. Para o enraizamento o meio contendo 3,0 mg.L-1 de ANA foi o mais eficiente, apresentando uma média de 2,53 raízes/explante. Em relação à indução de calo, todos os tratamentos apresentaram calogênese, porém o meio suplementado com 4,0 mg.L-1 de BAP + 6,0 mg.L-1 de 2,4-D, apresentou a melhor média, 1,67 calos/explante.

The objective of this work was to establish a protocol for in vitro regeneration of rosewood (Aniba rosaeodora Ducke), using apical and nodal segments inoculated in culture medium with various concentrations of growth regulators. Explants disinfected with solutions of benomyl (4,0 g.L-1) for 24 hours and sodium hipoclorite in 20% + tween 20 for 20 minutes were submitted in an experiment of shoot, root and callus induction in MS medium, with 30 g.L-1 of sucrose and 9,0 g.L-1 of agar added with the growth regulators: BAP (0,0 and 4,0 mg.L-1), ANA, AIA and 2,4-D (0,0; 3,0 and 6,0 mg.L-1), and their respective combinations. The design was complete randomized in arranged factorial 7 X 2, with 14 treatments and 15 replications, where about the explants were analysed the number of shoot, root and callus . After 90 days, the results showed that the presence of auxins is fundamental to induce buds, roots and callus . The medium was contained 4,0 mg.L-1 BAP + 6,0 mg.L-1 AIA showed the best average for shooting with 2,13 buds/explants. In the rooting, the medium was contained 3,0 mg.L-1 of ANA was the more efficient, showed 2,53 roots/explant. However, all the treatments obtained formation of callus, but the medium with 4,0 mg.L-1 BAP + 6,0 mg.L-1 2,4-D showed the best result,1.67 callus/explant.

Adventitious shoots from nodule cluster cultures of Vriesea reitzii: an endemic and endangered bromeliad from atlantic forest / Brotos adventícios a partir de culturas nodulares de Vriesea reitzii: uma bromélia endêmica e em extinção da Mata Atlântica

The Atlantic Forest is a biome with megadiversity and a number of bromeliads take part of it. This is the case of Vriesea reitzii, an endemic bromeliad threatened with extinction. Tissue culture techniques are valuable tools for the mass propagation of bromeliads, thus reducing pressure in the natural habitat. The aim of the present work was to establish an in vitro protocol based on the induction and proliferation of nodule cluster cultures of this species. Plantlets maintained in MS liquid culture medium plus NAA (2µM) and BAP (4µM) had the basal regions of leaves excised and then inoculated in gelled with agar (7g L-1) MS culture medium plus with Dicamba (2.5; 5; 10; 20 e 30µM) and Kin (2µM) or free of plant growth regulators. Nodule cluster cultures arose from the basal region of explants. The subculture to MS liquid medium plus GA3 (10µM) and in MS liquid medium free of plant growth regulators resulted in a high proliferation rate. The mean regenerative rate was 39 plantlets/0.03g of nodule culture. Plantlets were acclimatized in a mix substrate of 1:1 (v:v) of carbonized rice coat and Turfa Fertil® mineral supplement.

A floresta tropical atlântica é um bioma de alta diversidade, rico em espécies endêmicas de bromélias, entre elas Vriesea reitzii, que se encontra ameaçada de extinção. Técnicas de cultura de tecidos possibilitam a propagação massal de bromélias, reduzindo a pressão de coleta na natureza. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo regenerativo baseado na indução e no desenvolvimento de culturas nodulares desta espécie. Plantas multiplicadas em meio MS líquido com ANA (2µM) e BAP (4µM) tiveram suas folhas excisadas e inoculadas em meio MS geleificado com ágar (7g L-1) e suplementado com Dicamba (2,5; 5; 10; 20 e 30µM) e Kin (2µM) ou isento de fitorreguladores. A indução de culturas nodulares foi observada na região basal dos explantes. Estas culturas foram subcultivadas em meio de cultura MS líquido suplementado com GA3 (10µM) e subseqüentemente para meio MS líquido isento de fitorreguladores, resultando em altas taxas de proliferação de culturas nodulares que originaram brotos adventícios e microbrotos. A taxa média de regeneração foi de 39 brotos/0,03g de culturas nodulares. As mudas foram aclimatizadas com sucesso em substrato composto por fertilizante organomineral Turfa Fértil® e casca de arroz carbonizada na proporção de 1:1 (v:v).

Controle genético da regeneração in vitro em progênies de Eucalyptus grandis / Genetic control of in vitro regeneration of Eucalyptus grandis

Com o objetivo de avaliar o controle genético da regeneração direta in vitro a partir de plântulas de Eucalyptus grandis, foram utilizadas sementes de 10 progênies de polinização aberta da população base, origem Atherton, localizada em Anhembi, Estado de São Paulo. Vinte dias de cultivo após a germinação, 196 segmentos distais dos hipocótilos por progênie foram inoculados in vitro num Delineamento em Blocos Completos Aleatorizado Generalizado, com duas unidades experimentais por bloco e sete repetições por bloco, usando a interação blocos por progênie como estimadora do erro experimental. Após 14 semanas de cultivo, foram feitas avaliações da regeneração. Houve diferenças significativas de regeneração entre as progênies (P<0,0001) com extremos de regeneração de 11 por cento a 60 por cento. A herdabilidade no sentido restrito entre as médias das unidades experimentais do caráter foi alta (h2m=0,94), indicando que houve um forte controle genético na regeneração in vitro dentro da população. Houve também alta variabilidade dentro da amostra estudada, assim como um forte efeito do progenitor materno sobre a regeneração.

The genetic control of in vitro direct regeneration was tested on seedlings of ten open-pollinated progenies from the base population of Atherton origin of Eucalyptus grandis at University of São Paulo (Brazil). Seeds were germinated in vitro, after twenty days, distal hypocotyls segments from 196 seedlings per progeny were inoculated in culture media at Generalized Complete Randomized Block Design, with two experimental units per block and seven repetitions, using the interaction blocks by progenies as an estimate of the experimental error. At week 14 from the inoculation bud induction was evaluated. Regeneration among progenies were significantly different (P<0.0001). Regeneration varied from 11 to 60 percent. The narrow-sense heritability between means of experimental units for in vitro regeneration was height. (h2m=0.94), indicating a strong genetic control of the trait within the population and also a high maternal effect. High variability within the study sample was found.