Identificación molecular del sexo en 9 especies de aves del Centro de Investigación en Animales Silvestres de la hidroeléctrica de Itaipu, lado paraguayo / Sex identification by molecular methods in 9 species of birds from the wild animal research center of Itaipu dam on the paraguayan side

La importancia de determinar el sexo en especies monomórficas que viven en cautiverio conlleva a estrategias de apareamiento a fin de poder incentivar la reproducción. Existen métodos no moleculares de reconocimiento pero son factibles en edad adulta y mucho más difícil cuando son polluelos. Mediante la técnica molecular de PCR, se amplificó el gen de la Cromo Helicasa de Unión al ADN empleando los cebadores, 2550F/2718R. Por este método molecular se consiguió determinar el sexo en 19 de 23 especies de las cuales 3 son ejemplares de: Amazona aestiva, 1 de Pipile grayi, 1 de Bubo virginianus, 4 de Ara chloropterus, 6 de Crax fasciolata, 2 de Caracara plancus, 3 de Chauna torquata, 1 de Cariama cristata y 2 de Cairina moschata del Centro de Investigación de Animales Silvestres de ITAIPU binacional, del lado paraguayo. Nuestros resultados sugieren que el par de cebadores 2550F/2718R podría ser de utilidad para determinar el sexo en las especies estudiadas en el país.

In monomorphic species living in captivity, determining the sex is important because it may allow choosing mating strategies to enhance reproduction. Sex can be determined either by non-molecular recognition methods, which are only feasible in adult birds, or by molecular techniques, which may allow sexing monomorphic species at young ages. Thus, in this study, we used molecular techniques such PCR to amplifying the CHD gene by using 2550F/2718R primers. This method allowed us to determine the sex in 19 out of 23 bird specimens from the Centro de Investigación de Animales Silvestres (CIASI) of the ITAIPÚ BINACIONAL at Paraguayan side. The specimens belonged to the following species: Amazona aestiva (3), Pipile grayi (1), Bubo virginianus (1), Ara chloropterus (4), Crax fasciolata (6), Caracara plancus (2), Chauna torquata (3), Cariama cristata (1) and Cairina moschata (2). The 2550F/2718R primers were useful for determine the sex of the studied species.

Un método molecular rápido, no invasivo y simple para determinar el sexo en pingüinos pigoscélidos / A rapid, non invasive and simple molecular method for sex determination in pygoscelis penguins

En los pingüinos Adélie (Pygoscelis adeliae) y pingüinos gentoo (Pygoscelis papua), no existe un dimorfismo sexual conspicuo y a menudo resulta difícil determinar el sexo en base a la morfología externa. La información sobre el sexo es importante en muchos estudios de ecología y conservación. En este artículo se evaluó el uso de un par de cebadores (2550F/2718R) para identificar el sexo en aves sexualmente monomórficas. Para ambas especies de pingüinos la amplificación produjo dos bandas discretas, CHD1Z y CHD1W, que permitieron la identificación sexual. Se trata de un sistema sencillo, rápido y económico para el sexaje molecular de los pingüinos gentoo y Adélie.

In Adélie penguins (Pygoscelis adeliae) and gentoo penguins (Pygoscelis papua), the conspicuous sexual dimorphism often makes it difficult to determine sex on the basis of external morphology. The information about sex is important in many ecology and conservation studies. In this paper we evaluated the use of an established primer pair (2550F/2718R) to identify sex in sexually monomorphic birds. In both penguin species, it resulted in two distinct CHD1Z and CHD1W PCR bands, allowing sex identification. This is a simple, rapid and cheap system for molecular sexing of gentoo and Adélie penguins.

Comportamiento del semen bovino sexado congelado-descongelado en fertilización in vitro (FIV) capacitado mediante BO en dos concentraciones versus percoll / Behavior of sexed frozen-thawed bovine semen on in vitro fertilization (IVF) capacitated with two concentrations of BO versus percoll

RESUMEN: El objetivo fue comparar la tasa de división (TD) y desarrollo embrionario (DE) con semen sexado X (SX) en FIV capacitado con Percoll vs. BO, y evaluar el efecto de dos concentraciones (5x106 vs. 10x106 espermatozoides/ml), capacitado con BO, comparado con el semen no-sexado (NS). Un avance importante es predeterminar el sexo en bovinos, es posible obtener mayor proporción de terneras a partir del citómetro de flujo con la capacidad de seleccionar los espermatozoides X por la diferencia del ADN (4 %, bovinos), con confiabilidad del 90 %. El SX aumenta la eficiencia reproductiva, permite la selección de hembras e incrementa la ganancia genética. Se obtuvieron complejos ovocito cúmulus (COC), de ovarios de matadero, se cultivaron para maduración en gotas de 100 µl de TCM-199 + 5 % de suero fetal bovino + 0.005 U/ml de (FSH-p) + 10 IU hCG/ml + 1µg Estradiol (E2)/ml, 15 COC/gota, cubiertas con aceite mineral, en incubadora (38,5 ºC, 5 % de CO2 y 95 % de humedad), 22 h. Posmaduración se dividieron en 4 grupos (G1, G2, G3, G4) y se realizaron dos experimentos simultáneamente: I) G1: NS a 5x106, G2: SX a 5x106, G3: SX a 10x106 espermatozoides/ml capacitados con BO. II) G2: SX a 4,5x106 espermatozoides/ml capacitados con BO y G4: SX capacitado con Percoll a 5x106 espermatozoides/ ml. Se colocaron 15 COC/gota de semen cubiertas con aceite mineral, en incubadora, 18 h. Para el desarrollo se colocaron en gotas de CR1aa, en incubadora. Se aplicó el test de χ2. La TD a las 48 h entre G1 y G3 no presentó diferencias significativas (p<0,05), sin embargo, en ambos grupos fue significativamente mayor al G2. En el DE al día 7 hubo diferencias significativas (p<0,05) a favor del G4. Se obtuvo mayor DE con el SX capacitado con Percoll respecto al BO y no hubo diferencias entre ambas concentraciones de semen.

SUMMARY: The objective of this study was to evaluate the in vitro fertility of bovine sexed semen (SX) capacitated with Percoll vs. BO. The division rate (DR), embryo development (ED) were evaluated in two concentrations 5x106 vs. 10x106 sperm/ml, capacitated with BO and compared with non-sexed semen (NS). Offspring sexing represents an important advance for livestock production. Flow cytometry separates X and Y spermatozoa by difference in DNA content (4 % greater in X) with 90 % effectiveness. The SX increases the reproductive efficiency, allows the selection of females and increases the genetic gain. Cumulusoocytes complexes (COC) were obtained from slaughterhouse ovaries. They were then cultured 22 hours for maturation in TCM199 + 5 % fetal calf serum + 0.005 IU/ml (FSH-p) + 10 IU hCG/ml + 1 mg Estradiol (E2)/ml, in 100 µl drops with mineral oil, in incubator (38.5 ºC, 5 % CO and 95 % humidity). Post maturation, 4 groups were randomly assigned (G1, G2, G3, G4) and were performed two experiments simultaneously: I) G1 was inseminated with NS at 5x106 sperm/ml, G2: SX at 5x106, G3: SX at 10x106 sperm/ml capacitated with BO. II) G2: SX at 5x106 sperm/ml capacitated with BO and G4: SX capacitated with Percoll at 5x106 sperm/ml. 15 COC/drop of capacitated semen covered with mineral oil and placed in an incubator for 18 hours. For development, they were placed in drops of CR1aa, in an incubator. Results were analyzed with the c square test. At 48 hours, there were no significant differences (p<0.05) in DR between G1 and G3, however, in both groups it was significantly greater than G2. At day 7 there were significant differences (p <0.05) in ED, greater in G4. At 48 hours, there were no significant differences (p<0.05) in DR between G1 and G3, however, in both groups it was significantly greater than G2. At day 7 there were significant differences (p <0.05) in ED, greater in G4. A higher ED was obtained with the SX capacitated with Percoll, with respect to BO and there was no difference between the two semen concentrations.

Semen bovino sexado congelado-descongelado en producción de embriones in vitro / In vitro embryo production with frozen-thawed bovine semen sexed

El objetivo de este trabajo fue evaluar la fertilidad in vitro del semen bovino sexado (SX) vs. no sexado (NS) congelado-descongelado de dos toros Holstein, cada uno de la misma partida. Determinar el sexo de las crías significa un avance importante para la producción. El citómetro de flujo separa los espermatozoides X e Y por diferencia de ADN (4 % mayor en X), con 90 % de efectividad. Los complejos ovocito-cúmulus (COC) se obtuvieron de folículos de 2 a 8 mm de ovarios de frigorífico, se cultivaron para maduración 22 h en TCM-199 + 5 % de SFB + 10 % licor folicular bovino (LFB), en gotas de 100 µl, cubiertos con aceite mineral, en incubadora (38,5 C, 5 % CO2 y 95 % de humedad). Posmaduración, se formaron al azar 4 grupos de COC los cuales fueron inseminados con NS y SX de los toros 1 y 2. Los COC se incluyeron en gotas de 100 ml a razón de 10 COC por gota de semen capacitado a una concentración de 2x106 espermatozoides/ml en todos los grupos, incubados durante 6 h. Posteriormente se cultivaron en CR1aa + 5 % SFB, en incubadora. A las 48 h se evaluó el clivaje y al día 7 el desarrollo embrionario. Los resultados fueron analizados con el Test de c2. Se encontró diferencias significativas en el toro 1 en el desarrollo embrionario a favor del NS (p<0,05). En el toro 2 no se encontró diferencias significativas en el clivaje ni en el desarrollo (p<0,05).

The objective of this study was to evaluate the in vitro fertility of sexed (SX) vs. non-sexed (NS), frozen-thawed bovine semen from two Holstein bull, from the same batch each one. Offspring sexing represents an important advance for livestock production. Flow cytometry separates X and Y spermatozoa by difference in DNA (4 % greater in X) with 90 % effectiveness. Cumulus-oocytes complexes (COC) were obtained from follicles measuring between 2 and 8 mm collected from slaughterhouse ovaries; they were then cultured 22 h for maturation in TCM-199 + 5 % BFS + 10 % bovine follicular fluid (BFF) in 100 µl drops with mineral oil, in incubator (38.5 C, 5% CO2 and 95 % humidity). Postmaturation, 4 groups were randomly formed and inseminated with NS and SX of the 1 and 2 bulls, including them in 100 µl drops at 10 COC per drop of capacitated semen diluted to a concentration of 2x106 sperms/ml in all groups, incubated during 6 h. They were then cultured in CR1aa + 5% BFS in an incubator. At 48 h cleavage and at day 7 embryonic development, were assessed. Results were analyzed with c2 square Test. There were significant differences (P<0.05) in the embryonic development in bull 1, grater in NS. In bull 2 there were not significant differences in cleavage neither in embryo development.

Effect of db-camp on embryonic development of bovine oocytes fertilized with sex sorted semen. / Efecto del db-cAMP Sobre el Desarrollo Embrionario de Ovocitos Bovinos Fecundados con Semen Sexado.

The objective of this study was to improve sexed bovine embryo production with sorted sperm in chemically defined conditions by supplementing the IVF medium with db-cAMP. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured for 18 h in supplemented TCM-199 and fertilized with X- or Y-bearing sperm in the presence of heparin (10 µg/ml), db-cAMP (1 µM) or no treatment (control). Presumptive zygotes were cultured 54 h in g-SOF. From 72 to 144 h post- insemination (hpi) embryos were cultured in c-SOF+NEA and from 144 to 192 hpi embryos were placed in maturation medium without hormones. No significant differences were found among treatments for Y-sperm when compared to controls. A significant (P<0.01) improvement in the proportion of cleaved oocytes was found for X-sperm treated with db-cAMP (70.83%) compared to the Y-sperm inseminated oocytes treated wit db-cAMP (46.37%). Treatment with db-cAMP enabled a better (P<0.05) blastocyst formation rate (19.29%) compared to control (8.47%) and heparin (10.44%). Treatment of db-cAMP significantly increased the rate of blastocysts in X-sperm inseminated oocytes (30.77%) compared to Y-sperm inseminated oocytes treated the same (9.68%) and compared to X- and Y-sperm treated with heparin (5.88% and 15.15%, respectively) and not treated (9.68% and 7.14%, respectively, P<0.05). These results suggest that db-cAMP may prove to be an effective treatment of sorted sperm for in vitro production of female bovine embryos under chemically defined conditions.

El objetivo de este estudio fue mejorar la producción de embriones bovinos con semen sexado bajo condiciones químicamente definidas mediante la suplementación del medio de fecundación con db-cAMP. Los complejos ovocitos cumulus (COCs) fueron madurados por 18 horas en TCM-199 suplementado y fueron fecundados con espermatozoides X o Y en presencia de heparina (10 g/ml), db-cAMP (1 µM) o sin tratamiento alguno (control). Los presuntivos cigotos fueron cultivados por 54 horas en g-SOF. Desde las 72 a las 144 horas post-inseminación (hpi) los embriones se cultivaron en c-SOF+NEA y desde 144 a 192 hpi fueron colocados en medio de maduración pero sin hormonas. No se observaron diferencias entre tratamientos para los oocitos fecundados con espermatozoides Y cuando se compararon a los controles. Se observó una mejora significativa (P<0,01) en la proporción de ovocitos que se dividieron cuando fueron fecundados con espermatozoides X tratados con db-cAMP (70,83%) en comparación con los fecundados con espermatozoides Y tratados con db-cAMP (46,37%). El tratamiento con db-cAMP fue capaz de inducir una mayor (P<0,05) tasa de formación de blastocistos (19.29%) en comparación a los tratamientos control (8,47%) y heparina (10,44%). El tratamiento con db-cAMP incrementó (P<0,05) la tasa de embriones de cuatro células alcanzando el estadio de blastocisto cuando los oocitos fueron fecundados con espermatozoides X (30,77%) en comparación a cuando la fecundación se realizó con espermatozoides Y (9,68%) y en comparación a cuando se llevó a cabo con espermatozoides X o Y en presencia de heparina (5,88% y 15,15%, respectivamente) o en el tratamiento control (9,68% y 7,14%, respectivamente). Estos resultados sugieren, que el db-cAMP puede ser un tratamiento efectivo para el semen sexado, a fin de incrementar la producción in vitro de embriones bovinos hembra bajo condiciones químicamente definidas.