Estudo da permeabilidade de fármacos por meio do modelo de saco intestinal de ratos / Study of drug permeability through the rat gut sac model

Os parâmetros de permeabilidade e solubilidade são fundamentais à absorção oral de fármacos e a partir dessas características, foi criado o Sistema de Classificação Biofarmacêutica, através do qual os fármacos são divididos em quatro classes. Atualmente, para a determinação da solubilidade de um fármaco, existem diversos métodos padronizados por agências regulatórias, no entanto, para a determinação da permeabilidade, os ensaios são passíveis de diversas variações em sua execução, diminuindo a confiabilidade dos resultados obtidos e impossibilitando a comparação dos mesmos quando realizados com técnicas diferentes umas das outras. O objetivo do presente trabalho é avaliar as variáveis experimentais do modelo do saco intestinal que podem influenciar nos resultados de permeabilidade aparente de fármacos e na viabilidade do tecido. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da FCF-USP (109.2018-P574). Foram utilizados 33 Rattus norvegicus da linhagem Wistar, machos, jovens adultos, com peso entre 200 g e 300 g. Para realização do procedimento, cada animal permaneceu em jejum por cerca de quatro horas e após adequada anestesia a porção do jejuno do intestino delgado foi retirada e dividida em seis segmentos de aproximadamente 8,5cm cada. Foram realizados experimentos com e sem inversão do saco intestinal, submetidos a diferentes tempos de banho de gelo após sua ressecção, na presença ou ausência de inibidor da glicoproteína-P (verapamil). Os fármacos naproxeno e famotidina foram empregados como marcadores de alta e baixa permeabilidade, respectivamente. A losartana foi utilizada como substrato da glicoproteína P. Cada um dos sacos intestinais foi colocado em um tubo de ensaio contendo tampão Krebs, a 37°C, saturado com gás carbogênio. Para avaliação da integridade e viabilidade dos segmentos intestinais, observou-se a presença de movimentos peristálticos e coletaram-se amostras do meio de incubação nos tempos 0, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos para quantificação dos fármacos e de glicose, uma vez que esta é ativamente transportada para a serosa do intestino delgado. Determinou-se a permeabilidade aparente de cada fármaco e as concentrações de glicose nas diferentes condições experimentais, realizou-se planejamento fatorial multinível e os resultados foram analisados por análise variância (ANOVA), seguida de pós-teste de Tukey. Observou-se que as variáveis experimentais interferiram de forma significativa na viabilidade tecidual e na permeabilidade aparente dos fármacos. Não foram observadas diferenças significativas da permeabilidade de fármacos nos diferentes segmentos do jejuno. A glicose mostrou-se um bom marcador de viabilidade tecidual e foi constatado que a presença ou ausência de movimentos peristálticos não está relacionada diretamente com a viabilidade do tecido. Uma vez que foram constatadas tantas interferências nos resultados, é imprescindível que os procedimentos experimentais sejam padronizados, para que os resultados apresentem menor variabilidade e possam ser comparados entre si

The permeability and solubility parameters are fundamental to the oral absorption of drugs and from these characteristics, the Biopharmaceutical Classification System was created, through which drugs are divided into four classes. Currently, for the determination of the solubility of a drug, there are several methods standardized by regulatory agencies, however, for the determination of permeability, the tests are subject to several variations in their execution, reducing the reliability of the results obtained and making it impossible to compare the results obtained. same when performed with different techniques. The aim of this study is to evaluate if different experimental conditions can influence the results of apparent drug permeability and tissue viability on gut sac model. The present study was approved by the Ethics Committee for the Use of Animals of FCF-USP (109.2018-P574). Thirty-three male, young adult Rattus norvegicus were used, weighing between 200 g and 300 g. To perform the procedure, each animal fasted for about four hours and after adequate anesthesia, the portion of the jejunum of the small intestine was removed and divided into six segments of approximately 8.5 cm each. Experiments were performed with and without inversion of the gut sac, submitted to different times of ice bath after its resection, in the presence or absence of a P-glycoprotein inhibitor (verapamil). The drugs naproxen and famotidine were used as markers of high and low permeability, respectively. Losartan was used as a substrate for P-glycoprotein. Each of the gut sacs was placed in a test tube containing Krebs buffer, at 37°C, saturated with carbogen gas. To evaluate the integrity and viability of the intestinal segments, the presence of peristaltic movements was observed and samples of the incubation medium were collected at 0, 30, 45, 60, 90 and 120 minutes for quantification of drugs and glucose, as it is actively transported to the serosa of the small intestine. The apparent permeability of each drug and the glucose concentrations were determined under different experimental conditions, multilevel factorial design was performed and the results were analyzed by analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey's post-test. It was observed that the experimental variables significantly interfered in the tissue viability and in the apparent permeability of the drugs. No significant differences in drug permeability were observed in the different segments of the jejunum. Glucose proved to be a good marker of tissue viability and it was found that the presence or absence of peristaltic movements is not directly related to tissue viability. Since so many interferences were found in the results, it is essential that the experimental procedures be standardized, so that the results show less variability and can be compared between different authors

Requisitos de bioisenção com base no Sistema de Classificação Biofarmacêutica no Brasil e no mundo / Biowaiver requirements based on the Biopharmaceutical Classification System in Brazil and worldwide

O acesso a medicamentos pode ser facilitado por programas globais de desenvolvimento farmacêutico, mas há necessidade de que as agencias regulatórias e as indústrias farmoquímicas e farmacêuticas interajam e haja um consenso quanto as exigências para o registro de medicamentos. Este artigo examinou a legislação especifica sobre bi isenção com base no Sistema de Classificação Biofarmacêutica, comparando os cenários do Brasil e do mundo. A partir dessa análise, identificou os entraves a aplicação dos critérios internacionais na realidade regulatória nacional, identificando algumas fragilidades da legislação, como no caso de pro-fármacos. Analisaram-se os critérios de cinco organismos regulatórios (Agência Europeia de Medicamentos, Food and Drug Administration, Health Canada, Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos para Medicamentos de Uso Humano e Organização Mundial da Saúde) frente aos requisitos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, pontuando as diferenças e o que já se encontra pacificado no tocante a classe do Sistema de Classificação Biofarmacêutica aceita, a comparabilidade entre formulação teste e de referência, solubilidade, permeabilidade intestinal e perfil de dissolução in vitro. Concluiu--se que a Agência Nacional de Vigilância Sanitária deve internalizar os preceitos e critérios da bioisenção com base no Sistema de Classificação Biofarmacêutica por meio de um novo marco regulatório. Além disso, para que esse marco regulatório seja bem-sucedido e produza resultados palpáveis, em especial na área de saúde publica e vigilância sanitária, a agência brasileira deve estar aberta ao diálogo com o setor regulado e as inovações e orientações da academia, sem desviar o foco de sua missão institucional.

Access to medicines can be facilitated by global pharmaceutical development programs, but there is a need for regulatory agencies and the pharmochemical and pharmaceutical industries to interact and to have a consensus on the requirements for drug registration. This article examined the specific legislation concerning to biowaiver based on the Biopharmaceutical Classification System, comparing the scenario in Brazil and worldwide. Based on this analysis, it identified the obstacles to the application of international criteria in the national regulatory reality, identifying some weaknesses of the legislation, as in the case of prodrugs. The criteria of five regulatory bodies (European Medicines Agency, Food and Drug Administration, Health Canada, International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use and World Health Organization) were analyzed in relation to the requirements of the Brazilian Health Regulatory Agency (Anvisa), pointing out the differences and what has already been settled regarding the accepted class of the Biopharmaceutical Classification System, the comparability between test and reference formulations, solubility, intestinal permeability and in vitro dissolution profile. It was concluded that Anvisa should internalize the percepts and criteria of the biowaiver based on Biopharmaceutical Classification System, through a new regulatory framework. Moreover, for this regulatory framework to be successful and produce tangible results, especially in the area of public health and health surveillance, Anvisa must be open to dialogue with the regulated sector and to innovations and guidance from academia, without losing focus of its institutional mission.

Biopharmaceutics classification system: importance and inclusion in biowaiver guidance

Pharmacological therapy is essential in many diseases treatment and it is important that the medicine policy is intended to offering safe and effective treatment with affordable price to the population. One way to achieve this is through biowaiver, defined as the replacement of in vivo bioequivalence studies by in vitro studies. For biowaiver of new immediate release solid oral dosage forms, data such as intestinal permeability and solubility of the drug are required, as well as the product dissolution. The Biopharmaceutics Classification System (BCS) is a scientific scheme that divides drugs according to their solubility and permeability and has been used by various guides as a criterion for biowaiver. This paper evaluates biowaiver application, addressing the general concepts and parameters used by BCS, making a historical account of its use, the requirements pertaining to the current legislation, the benefits and risks associated with this decision. The results revealed that the use of BCS as a biowaiver criterion greatly expands the therapeutics options, contributing to greater therapy access of the general population with drug efficacy and safety guaranteed associated to low cost.

O tratamento farmacológico é essencial frente a várias patologias e é fundamental que a política de medicamentos tenha por objetivo oferecer à população tratamento seguro, eficaz e de preço acessível. Uma forma de alcançar esse objetivo é por meio da bioisenção, definida como a substituição de estudos de bioequivalência in vivo por estudos in vitro. Para bioisentar novos medicamentos sob a forma farmacêutica sólida oral de liberação imediata são utilizados dados de permeabilidade intestinal e solubilidade do fármaco, bem como sua dissolução a partir da forma farmacêutica. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) é um esquema científico que divide os fármacos em classes de acordo com a solubilidade e permeabilidade e vem sendo utilizado como critério para bioisenção em diversas legislações. O presente artigo faz uma avaliação da aplicação da bioisenção, abordando os conceitos gerais e parâmetros utilizados pelo SCB, fazendo um relato histórico da aplicação da bioisenção, das exigências pertinentes às legislações vigentes, dos benefícios e riscos inerentes a uma tomada de decisão sobre bioisenção baseada neste critério. Os resultados revelaram que a utilização do SCB como critério amplia enormemente as possibilidades de bioisenção, contribuindo para o maior acesso da população em geral a medicamentos com garantida eficácia, segurança e menor custo.

Development and optimization of self microemulsifying drug delivery of domperidone

The present investigation is aimed to develop self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS) to improve the in vitro dissolution of a BCS (Biopharmaceutical Classification System) class II anti emetic agent, domperidone. Solubility study was performed to identify the ingredients showing highest solubility of domperidone. The ternary phase diagrams were plotted for selected components to identify the area of microemulsion existence. D-optimal mixture experimental design was applied to optimize a liquid SMEDDS using formulation variables; the oil phase X1 (Oleic acid), the surfactant X2 (Labrasol) and the co-surfactant X3 (Transcutol HP). The liquid SMEDDS were evaluated for droplet size, emulsification time, % transmittance and drug release. Stability study was performed at 40 °C/75% RH. Liquid formulation was solidified by adsorption on carrier Aerosil 300. Solid SMEDDS was evaluated and compared with liquid SMEDDS and marketed formulation. Oleic acid was selected as oil, Labrasol as surfactant and Transcutol HP as co-surfactant for formulation of SMEDDS. The optimized batch showed best results in terms of smaller droplet size (<170 nm), emulsification time (<40 s) and drug release (>85% in 15 min) and was stable for 3 months. Solid SMEDDS containing Aerosil 300 showed good flow properties and uniform drug content. XRPD study revealed that the crystalline drug was converted to amorphous form in solid SMEDDS. The rate and extent of drug dissolution from solid SMEDDS was significantly higher than pure drug and commercial tablet formulation. The results demonstrate the potential of SMEDDS as a means of improving solubility, dissolution and hence the bioavailability.

O presente estudo teve como objetivo desenvolver sistemas de liberação auto-microemulsificantes (Self-Microemulsifying Drug Delivery System - SMEDDS) de domperidona, agente antiemético, classe II, segundo o sistema de classificação Biofarmacêutica, para melhorar sua dissolução in vitro. Estudo foi realizado para identificar os componentes que revelaram maior solubilidade da domperidona. Determinaram-se os diagramas de fase ternários para esses componentes selecionados tendo em vista a identificação da região de formação da microemulsão. O planejamento experimental foi empregado para otimizar os SMEDDS líquidos, utilizando as seguintes variáveis de formulação: a fase oleosa X1 (ácido oleico), o agente tensoativo X2 (Labrasol) e co-tensoativo X3 (Transcutol HP). Os SMEDDS líquidos foram avaliados quanto às seguintes características: tamanho da gota, tempo de emulsificação,% de transmitância e liberação do fármaco. O estudo de estabilidade foi realizado a 40 °C/75% de umidade relativa. A formulação foi convertida em forma sólida por sua adsorção em Aerosil 300. Os SMEDDS sólidos foram avaliados e comparados com SMEDDS líquidos e a formulação comercializada. O ácido oléico foi selecionado para a fase oleosa, Labrasol como agente tensoativo e Transcutol como co-tensoativo para a formulação de SMEDDS. O lote otimizado mostrou os melhores resultados: menor tamanho de gota (<170 nm), menor tempo de emulsificação (<40 segundos), e de liberação do fármaco (> 85% em 15 min). Além disso, a formulação otimizada manteve-se estável no período de 3 meses. Os SMEDDS sólidos contendo Aerosil 300 apresentaram boas propriedades de fluxo e uniformidade de conteúdo do fármaco. O estudo de difração de raios-X revelou que o fármaco cristalino foi convertido para a forma amorfa, nos SMEDDS sólidos. A velocidade de dissolução do fármaco a partir dos SMEDDS sólidos foi significativamente maior, quando comparado ao fármaco livre e à formulação de comprimidos comercial. Os resultados demonstram o potencial dos SMEDDS como meio para melhorar a solubilidade, a dissolução e, consequentemente, a biodisponibilidade da domperidona.

The effect of dissolution medium, rotation speed and compaction pressure on the intrinsic dissolution rate of amlodipine besylate, using the rotating disk method

The aim of this study was to evaluate the effect of dissolution medium, rotation speed and compaction pressure on the intrinsic dissolution rate (IDR) of the antihypertensive drug amlodipine besylate, using the rotating disk method. Accordingly, a fractional factorial design (33-1) was used, employing dissolution media (water, phosphate buffer pH 6.8 and HCl 0.1 M), rotation speed (50, 75 and 100 rpm), and compaction pressure (1000, 1500 and 2000 psi) as independent variables. The assays were randomized and statistically compared using the Statistica(r) 11 software program. Significance testing (ANOVA) indicated that the dissolution medium had a considerable impact on the IDR of amlodipine besylate. Analysis of the linear and quadratic components of the variables led to the proposition of a mathematical model that describes the IDR as a function of the parameters studied. Conversely, the levels of compaction pressure and rotation speed employed during experimental planning were less relevant, especially when the assay was conducted in the HCl 0.1 M medium.

A finalidade do presente trabalho foi avaliar o efeito do meio de dissolução, velocidade de rotação e pressão de compactação na velocidade de dissolução intrínseca (VDI) do fármaco anti-hipertensivo besilato de anlodipino, usando o método do disco rotativo. Dessa forma, foi utilizado um planejamento experimental do tipo fatorial facionado (33-1) utilizando como variáveis independentes o meio de dissolução (água, HCl 0,1M e tampão fosfato pH 6,8), velocidade de rotação (50, 75 e 100 rpm) e pressão de compactação do fármaco (1000, 1500 e 2000 psi). Os ensaios foram randomizados e comparados estatisticamente pelo software Statistica(r) 11. A análise de variância (ANOVA) indicou que o meio de dissolução exerce considerável impacto na VDI do besilato de anlodipino. A análise das variáveis em seus componentes lineares e quadráticos permitiu a proposição de um modelo matemático que descreve a VDI em função dos parâmetros estudados. Por outro lado, os níveis de pressão de compactação e velocidade de rotação empregados exercem efeito menos relevantes, especialmente quando o ensaio é conduzido em HCl 0,1 M.

Equilibrium solubility versus intrinsic dissolution: characterization of lamivudine, stavudine and zidovudine for BCS classification

Solubility and dissolution rate of drugs are of major importance in pre-formulation studies of pharmaceutical dosage forms. The solubility improvement allows the drugs to be potential biowaiver candidates and may be a good way to develop more dose-efficient formulations. Solubility behaviour of lamivudine, stavudine and zidovudine in individual solvents (under pH range of 1.2 to 7.5) was studied by equilibrium solubility and intrinsic dissolution methods. In solubility study by equilibrium method (shake-flask technique), known amounts of drug were added in each media until to reach saturation and the mixture was subjected to agitation of 150 rpm for 72 hours at 37 ºC. In intrinsic dissolution test, known amount of each drug was compressed in the matrix of Wood's apparatus and subjected to dissolution in each media with agitation of 50 rpm at 37 ºC. In solubility by equilibrium method, lamivudine and zidovudine can be considered as highly soluble drugs. Although stavudine present high solubility in pH 4.5, 6.8, 7.5 and water, the solubility determination in pH 1.2 was not possible due stability problems. Regarding to intrinsic dissolution, lamivudine and stavudine present high speed of dissolution. Considering a boundary value presented by Yu and colleagues (2004), all drugs studied present high solubility characteristics in intrinsic dissolution method. Based on the obtained results, intrinsic dissolution seems to be superior for solubility studies as an alternative method for biopharmaceutical classification purposes.

A solubilidade e a taxa de dissolução de fármacos são de grande importância em estudos de pré-formulação de formas farmacêuticas. A melhora na solubilidade permite que os fármacos sejam candidatos potenciais à bioisenção, podendo ser uma boa maneira para desenvolver formulações dose-eficientes. O comportamento de solubilidade da lamivudina, estavudina e zidovudina em solventes individuais (sob faixa de pH 1,2 a 7,5) foi estudado pelos métodos de solubilidade em equilíbrio e dissolução intrínseca. No estudo de solubilidade pelo método do equilíbrio (método de agitação de frascos), conhecidas quantidades do fármaco foram adicionadas em cada meio até atingirem a saturação e a mistura foi submetida à agitação de 150 rpm por 72 horas a 37 ºC. No ensaio de dissolução intrínseca, conhecida quantidade de cada fármaco foi comprimida na matriz do aparato de Wood e submetida à dissolução em cada meio com agitação de 50 rpm a 37 ºC. No método de solubilidade em equilíbrio, a lamivudina e a zidovudina podem ser consideradas como fármacos altamente solúveis. Embora a estavudina apresente alta solubilidade nos meios pH 4,5, 6,8, 7,5 e água, a determinação da solubilidade em pH 1,2 não foi possível devido a problemas de estabilidade. Com relação à dissolução intrínseca, a lamivudina e a estavudina apresentaram alta velocidade de dissolução. Considerando o valor limite apresentado por Yu e colaboradores (2004), todos os fármacos apresentaram características de alta solubilidade no método de dissolução intrínseca. Com base nos resultados obtidos, a dissolução intrínseca parece ser superior para os estudos de solubilidade como um método alternativo para o propósito de classificação biofarmacêutica.

Padronização das condições para cultura de células Caco-2 visando à obtenção de membranas viáveis ao estudo da permeabilidade in vitro da rifampicina / Standardization of culture Caco-2 cells conditions to obtain viable membranes to study the in vitro permeability of rifampicin

A permeabilidade através do epitélio intestinal tem se tornado um importante aspecto a ser determinado nas avaliações biofarmacotécnicas envolvendo fármacos e medicamentos. A técnica mais empregada para essa determinação in vitro é aquela que utiliza a cultura de células Caco-2. Entretanto, ainda são discutíveis as condições para a realização desses experimentos, uma vez que a padronização das mesmas é fator fundamental para a confiabilidade dos resultados. Nesta tese, foram avaliadas as condições para realização dos estudos de permeabilidade através de membranas de células Caco-2 para a rifampicina, principal fármaco utilizado no tratamento da tuberculose. Para tanto, foram investigados fatores tais como a citotoxicidade da rifampicina em diferentes concentrações, a influência da concentração do fármaco sobre a permeabilidade, do pH de realização dos experimentos e da presença de proteínas do muco intestinal, além da influência de proteínas plasmáticas. Foi também investigado o potencial indutor da rifampicina sobre a expressão da glicoproteína-P (Pgp) e seu impacto na permeabilidade da própria rifampicina. Os estudos foram desenvolvidos utilizando membranas de células Caco-2 provenientes da American Type Culture Collection (ATCC) cultivadas em placas Transwel®, a quantificação da fração permeada foi por cromatografia líquida de alta eficiência com métodos validados. A análise da indução da expressão da Pgp foi realizada por PCR-RT. Demonstrou-se que as concentrações da rifampicina (10,0; 25,0 e 50,0 µg/mL) não ocasionaram danos às células Caco-2 no estudo de citotoxicidade pela técnica que emprega o sal do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). As concentrações de rifampicina (5,0; 10,0 e 25,0 µg/mL) não resultaram em valores estatisticamente diferentes de permeabilidade aparente (Papp) em células Caco-2 nas condições do estudo. A rifampicina apresentou valor de Papp significativamente maior em pH 6,8 dentre os valores de pH ...

The permeability through the intestinal epithelium has become an important aspect to be determined in evaluations involving drugs and pharmaceutical products. The most common technique for this determination in vitro is one that uses the culture of Caco-2 cells. Nevertheless, the conditions for carrying out such experiments are still questionable, since the standardization of them is essential to the reliability of the results. In this thesis, we evaluate the conditions for the studies of permeability of rifampicin through membranes of Caco-2 cells, the main drug used in the treatment of tuberculosis. To this end, we examined factors such as cytotoxicity of rifampicin at different concentrations, the influence of drug concentration on the permeability, as well as the pH of the experiments, the presence of proteins of intestinal mucus, and the influence of plasma proteins. It was also investigated the potential of rifampicin on the expression of P-glycoprotein (Pgp) and its impact on the permeability of rifampicin itself. The studies were developed using membranes of Caco-2 cells from American Type Culture Collection (ATCC) grown on plates Transwel®, and the quantification of the fraction of drug permeated was obtained by high performance liquid chromatography with validated methods. The analysis of induction of expression of Pgp was performed by RT-PCR. It was demonstrated that the concentrations of rifampicin (10,0; 25,0 and 50,0 µg/mL) did not cause damage to Caco-2 cells in the study of the cytotoxicity technique that uses a bromide salt of 3 - (4,5-dimethyl-2 - thiazol) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT). The concentrations of rifampicin (5,0; 10,0 and 25,0 µg/mL) did not result in statistically different values of apparent permeability (Papp) in Caco-2 cells under the conditions of the study. Rifampicin showed a value of Papp significantly higher at pH 6.8 in comparison with other measured pH values (5,8 and 7,4). The presence of mucus simulated and ...