Avaliação da toxicidade de partículas da exaustão do diesel em explantes de traqueia e cultura de células do epitélio respiratório: estudo da expressão gênica, citotoxicidade e sinalização celular / Toxicity tests on tracheal explants and respiratory epithelial cells exposed to diesel exhaust particles: a study on gene expression, cytotoxicity, and cell signaling

Partículas da exaustão de motores a diesel (DEP) têm propriedades toxicológicas, devido às características físico-químicas. O DEP é capaz de ativar as vias de sinalização intracelular e induzir alterações metabólicas em células e tecidos do sistema respiratório. O objetivo desta tese foi: 1) avaliar o perfil das mucinas e alterações epiteliais em explantes de traqueia de camundongo BALB/c expostos ao DEP e DEP tratado com ácido nítrico e solventes orgânicos; e 2) em cultura de células de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) expostas ao DEP e DEP tratado com hexano (DEP/HEX) para avaliar ativação de MAPK (ERK e JNK), citotoxidade, integridade de citoesqueleto, viscoelasticidade celular e expressão gênica de enzimas envolvidas no estresse oxidativo e apoptose. Os resultados mostraram que, em explantes de traqueia, o DEP causa aumento significativo em relação ao grupo controle na quantidade de muco ácido (p= 0,001), diminuição no muco neutro (p=0,001), diminuição de muco misto (p= 0,001), aumento de vacuolização (p= 0,001), aumento de apoptose (p=0,001), ora com aumento de pERK e diminuição de pJNK, e vice-versa. Os explantes submetidos à exposição ao DEP e DEP/MET aumentaram significativamente o muco ácido (p=0,01) e DEP/HEX provocou aumento da extrusão do muco (p=0,007), provavelmente devido à ação do enriquecimento inorgânico. Para as células BEAS-2B, nos resultados obtidos com células epiteliais expostas ao DEP e DEP/HEX, foram observadas alterações na membrana citoplasmática, mitocôndrias e citoesqueleto. As células expostas apenas ao DEP em baixas concentrações (15ug/mL) apresentaram alterações na expressão de genes envolvidos no apoptose (BCL-2 e Caspase-3 (p=0,05 e p=0,01) e estresse oxidativo [(SOD1 e SOD2 e GPx. p=0,01 )], e CYP1A1 ((p=0,01).

Diesel exhaust particles (DEPs) from diesel engines have toxic properties that result from their physical and chemical characteristics. DEPs are able to activate intracellular signaling pathways and induce metabolic changes to cells and tissues of the human respiratory system. This dissertation sought to evaluate: 1) the profile of mucins and the epithelial changes to the tracheal explants of BALB/c mice exposed to both DEP and DEP treated with nitric acid and organic solvents (50 and 100 ug/mL; and 2) human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) in culture after their exposure to both DEP and DEP treated with hexane (DEP/HEX) at 100 ug/mL in order to determine MAPK (ERK/JNK) activation, cytotoxicity, cytoskeletal integrity, cell viscoelasticity and gene expression of the enzymes involved in oxidative stress and apoptosis. The results show that, in tracheal explants, DEP causes a significant increase (compared to the control) in the quantity of acidic mucus (p=0.001), a decrease in alkaline mucus (p=0.001), a decrease in mixed mucus (p=0.001), an increase in vacuolization (p=0.001), an increase in apoptosis (p=0.001), along with an increase in pERK and a decrease in pJNK, and vice versa. The explants that were exposed to DEP and DEP/MET were found to have significantly higher quantities of acidic mucus (p=0.01), and DEP/HEX caused an increase in mucus extrusion (p=0.007), which was likely due to inorganic enrichment. In the case of BEAS-2B cells, the results obtained from epithelial cells exposted to DEP and DEP/HEX revealed alterations in the cytoplasmic membrane, the mitochondria, and the cytoskeleton. The cells exposed to DEP alone at low concentrations (15 ug/mL) experienced alterations in the genes involved in apoptosis (BCL-2 and Caspase-3; p=0.05 and p=0.01, respectively), as well as oxidative stress [(SOD1, SOD2, and GPx; p=0.01 )], and changes to CYP1A1 (p=0.01).

Papel das proteínas intracelulares nod e da proteína adaptadora myD88 na regulação de espressão de RANKL e modulação da resposta inflamatória induzidos por antígenos bacterianos in vitro: estudo em células relevantes de periodonto / Role of nod an myD88 proteins on the regulation of bacterial antigen-induced expression of RANKL and on the modulation of inflammation: a study on relevant cells of the periodontium

A reabsorcao do osso alveolar e uma das principais caracteristicas associadas a progressao da doenca periodontal. Apesar da enorme complexidade da microbiota envolvida, considera-se que bacterias Gram-negativas tenham um papel relevante em sua etiopatogenese. Um dos fatores de virulencia destes microrganismos e representado por um componente de sua parede externa denominado lipopolissacarideo (LPS). A presenca de LPS na proximidade dos tecidos periodontais e capaz de induzir a producao de diversos mediadores inflamatorios que levam a degradacao tanto do tecido conjuntivo quanto osseo. Atualmente acredita-se que a interacao do ligante do receptor-ativador do fator nuclear kappa-B (RANKL) com seu receptor (RANK) presente em precursores hematopoieticos e necessaria e suficiente para a inducao da diferenciacao de osteoclastos. Por outro lado, a ligacao de RANKL com seu falso-receptor, denominado osteoprotegerina (OPG), reduz sua biodisponibilidade e inibe, desta forma, a osteoclastogenese. Assim, a razao da expressao de RANKL e OPG e considerada como o principal determinante do “turnover” do tecido osseo. A producao de RANKL e OPG depende das vias de sinalizacao ativadas, as quais sao influenciadas pela natureza do estimulo extracelular. Atualmente, a familia de receptores NLRs (nod-like receptors) foi identificada como receptor intracelular para componentes bacterianos e agentes moduladores de diferentes vias de sinalizacao. Considerando a relevancia do LPS bacteriano na patogenese da doenca periodontal, o papel do RANKL no processo de reabsorcao ossea e a possivel implicacao das proteinas Nod na transducao de sinais regulando a expressao de RANKL, o objetivo geral deste projeto foi estudar os mecanismos de regulacao da expressao de RANKL induzido por LPS bacteriano em celulas relevantes do periodonto (macrofagos, osteoblastos e fibroblastos). Os objetivos especificos propostos...

Bone resorption is one of the major characteristics of destructive periodontal disease. Despite the great number of different bacterial species in the dental biofilm, Gramnegative microorganisms were demonstrated to have a very important role on periodontal disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) is a bacterial cell wall component, which is acknowledged as one of the main virulence factors of these microorganisms. The mere presence of LPS in proximity with the periodontal tissues initiates the expression and production of inflammatory mediators and other cytokines which can culminate in degradation of both soft and hard tissues. It is currently accepted that the interaction between receptor-activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) and its receptor (RANK) is both necessary and sufficient to induce osteoclast differentiation and activation. However, RANKL can interact with its soluble decoy receptor osteoprotegerin (OPG) inhibiting osteoclastogenesis by decreasing the bioavailability of RANKL. Production of RANKL/OPG is the result of the signaling pathways activated by external stimuli. Recently, the NLR (nod-like receptors) family was identified as cytosolic receptors for bacterial components and also, as capable of modulating different signaling pathways. Considering the relevance of LPS and RANKL in bone resorption and the possible implication of Nod proteins in signal transduction regulating RANKL expression, the aim of this study was to evaluate the influence of different intracellular signaling pathways on the regulation of RANKL expression induced by LPS in relevant cells of the periodontium (macrophages, osteoblasts and fibroblasts). The specific objectives proposed were to determine after LPS and interleukin-1 beta stimulation the role of MyD88-dependent and independent signaling pathways, Nod1 and Nod2 on the expression of RANKL, OPG, IL-10 and IFN-beta...

Expressão de MMP-13 e ativação de vias de sinalização intracelular em dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente em ratos / MMP-13 expression and signaling pathways activated in two models of experimentally-induced periodontal disease in rats

A progressão da doença periodontal é marcada pela excessiva produção de citocinas que, por sua vez, promove o aumento de outros mediadores inflamatórios, entre os quais, de metaloproteinases de matriz (MMPs). MMP-13 é uma colagenase de regulação complexa que tem sido relacionada à degradação da matriz extracelular (ECM) e à reabsorção óssea em diversas condições inflamatórias, incluindo doença periodontal e artrite reumatóide. A regulação da expressão gênica requer a ativação de várias vias de sinalização através da interação de receptores celulares específicos a estímulos externos, como antígenos bacterianos e citocinas derivadas do hospedeiro. A complexidade da rede de citocinas estabelecida durante a progressão da doença periodontal depende das vias de sinalização ativadas, as quais são influenciadas pela natureza do estímulo extracelular. Considerando o papel fundamental das vias de sinalização no controle da expressão gênica de citocinas e a relevante atividade de MMP-13 na doença periodontal, este estudo avaliou a expressão de MMP-13 e as vias de sinalização ativadas durante o curso de dois modelos de doença periodontal induzida experimentalmente. A expressão de MMP-13 nos níveis de RNA mensageiro (mRNA) e proteína foram avaliados por RT-PCR e Western Blot, respectivamente. A cinética de ativação das vias de sinalização intracelular relacionadas à expressão de mediadores inflamatórios também foi verificada por Western Blot. Estes achados foram relacionados à severidade da reação inflamatória determinada por estereometria. Dois modelos experimentais foram usados: injeção de LPS e colocação de ligadura. Injeções de LPS de Eschericia coli foram realizadas na região palatina de molares superiores 2 vezes por semana (30 µg por aplicação). Ligaduras foram colocadas na região cervical dos primeiros molares inferiores. O grupo controle recebeu injeções de PBS (veículo) na gengiva palatina dos primeiros molares superiores, enquanto ligaduras não foram colocadas nos molares inferiores. Amostras foram coletadas 5, 15 e 30 dias após a indução da doença periodontal e processadas para extração de RNA total e proteína, assim como rotineiramente processadas para análise histológica/estereométrica. Um aumento significante da severidade da inflamação foi observado em ambos os modelos já no período de 5 dias. Entretanto, o modelo de ligadura mostrou uma diminuição da intensidade da inflamação aos 30 dias, que não foi observada no modelo de injeção de LPS. O perfil de expressão dos níveis de mRNA de MMP-13, assim como a cinética das vias de sinalização ativadas durante o curso da doença periodontal foram distintos segundo o modelo experimental mas, em geral, acompanharam a severidade do processo inflamatório. De forma interessante, não houve correlação entre os níveis protéicos e de mRNA de MMP-13 em ambos os modelos, sugerindo uma regulação pós­transcricional da expressão de MMP-13 in vivo. Além disso, p38 e ERK MAPkinases, assim como NF- B foram ativadas nos dois modelos de doença periodontal, embora com cinética distinta; enquanto ativação de STAT3 e STAT5 foi verificada apenas no modelo de ligadura. Estes achados sugerem uma ativação diferencial de receptores celulares em cada forma de indução da doença periodontal, o que determina diferenças temporais e qualitativas nas redes de sinalização intracelular ativadas e influencia a regulação da expressão gênica de MMP-13 em cada modelo experimental

The hallmark of destructive periodontal disease progression is the overproduction of cytokines which promotes the increased expression of other inflammatory mediators such as, MMPs. MMP-13 is a collagenase of complex gene regulation that has been implicated on ECM degradation and bone resorption in several inflammatory conditions, including periodontal disease and rheumatoid arthritis. Regulation of gene expression requires the activation of several signaling pathways through receptor-ligand binding of external stimuli represented by bacterial antigens and/or host-derived cytokines. The complexity of the cytokine network established during periodontal disease progression results from the signaling pathways activated, which are determined by the nature of external stimuli. Thus, considering the fundamental role of signaling pathways on regulation of cytokine gene expression and the relevant role of MMP-13 in periodontal disease, this study evaluated the expression of MMP-13 and the signaling pathways activated during the course of two experimentallyinduced periodontal disease models. Expression of MMP-13 at mRNA and protein levels was evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot, respectively. The activation kinetics of some signaling pathways that are related to the expression of inflammatory mediators was also verified by Western Blot. The two experimental models used were: LPS injections and placement of ligatures. Bi-weekly injections of Eschericia coli LPS were done into the palatal aspect of upper molars (30 µg per injection). Ligatures were placed at the cervical portion of both lower first molars. The control animals received injections of PBS vehicle on the palatal gingiva of upper molars, whereas no ligatures were placed on the lower molars. Samples were collected 5, 15 and 30 days after beginning of periodontal disease induction and processed for extraction of total RNA and protein, as well as routinely processed for histology/estereometry. A significant increase on the severity of inflammation was observed in both experimental models already at the 5-day period. However, the ligature model presented a significant decrease on the intensity of inflammation at the 30-day period, which was not observed with the LPS injection model. MMP-13 expression profile, as well as the kinetic of signaling pathways activated during periodontal disease were somewhat different according to each experimental model, however paralleled the severity of inflammation. Interestingly, there was no transcription-translation coupling for MMP-13 in both models, suggesting a post­transcriptional regulation of MMP13 expression in vivo. Moreover, p38 and ERK MAPkinases, as well as NF-kB were activated in both periodontal disease models, however with different kinetics, whereas activation of STAT3 and STAT5 was verified only on the ligature model. These findings suggest a differential activation of cellular receptors in each model of experimentally-induced periodontal disease, which results in temporal and qualitative differences on the signaling network and influences MMP-13 gene regulation in each experimental model