ABSTRACT
En este presente trabajo, la diversidad genética de 30 morfotipos de papas nativas de Vilcashuamán (Ayacucho) fue evaluada mediante la técnica de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP). La extracción de ADN se realizó con el método de CTAB modificado, usando hojas frescas de plantas de cuatro semanas de cultivo en invernadero. Partiendo de 200 mg de tejido vegetal se logró obtener entre 300 a 500 ng/μL de ADN de buena calidad. La digestión enzimática del ADN se realizó utilizando EcoRI y MseI, y se emplearon 12 combinaciones de primers, de las cuales se eligieron las dos combinaciones más polimórficas (E13 - M49 y E38 - M49). El análisis estadístico se realizó con el programa NTSYs 2.10 usando el coeficiente de Simple Matching logrando obtener valores de PIC (índice de contenido polimórfico) de 0.45 y 0.40 para las combinaciones E38 - M49 y E13 - M49, respectivamente. En total se lograron identificar 68 bandas claramente diferenciables, de las cuales el 55.8% fueron bandas polimórficas. El análisis de agrupamiento según el algoritmo UPGMA originó un dendograma con un índice de correlación cofenética de r= 0.7; a un coeficiente de similitud de 0.6; se establecieron ocho grupos genéticos y a un coeficiente de 1 no se encontraron morfotipos duplicados. Los resultados obtenidos demuestran el alto poder informativo del AFLP y la alta variabilidad de las papas nativas estudiadas.
In this article, using the Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) technique, we evaluated the genetic diversity of 30 native potatoes morphotypes from Vilcashuaman, Ayacucho. DNA extraction was done with the modified CTAB method, using fresh leaves of greenhouse plants of two weeks age. From 200 mg of plant tissue, it was posible to obtain between 300 and 500 ng/μLof good quality DNA. The enzymatic digestion of the DNA was carried out using EcoRI and MseI, and 12 combinations of primers were used, from which the two most polymorphic combinations were chosen (E13 - M49 and E38 -M49). The statistical analysis was done with the NTSYs 2.10 program using the Simple Matching coefficient, obtaining values of PIC (polymorphic content index) of 0.45 and 0.40 for the combinations E38 - M49 and E13 - M49, respectively. In total, 68 clearly differentiable bands were identified, of which 55.8% were polymorphic bands. The cluster analysis according to the UPGMA algorithm originated a dendrogram with a cofenetic correlation index of r = 0.7; at a coefficient of similarity of 0.6, eight genetic groups were established and at a coefficient of 1, no duplicate morphotypes were found. The results obtained show the high informative power of the AFLP and the high variability of the native potatoes studied.
ABSTRACT
En este estudio se determinaron las relaciones filogenéticas y los niveles de variación de aislamientos de PVX obtenidos en tejidos foliares de plantas de Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro y S. phureja var. Criolla Colombia en Antioquia, utilizando métodos de secuenciación de nueva generación (NGS) y de Sanger. Inicialmente, se detectó el PVX mediante DAS-ELISA (Agdia-PSA10000), confirmándose su presencia en ocho de las muestras por Inmunocaptura-RT-PCR en tiempo real (IC-RT-qPCR). Los resultados de las pruebas serológicas indicaron la infección de PVX en 14,7 % y 13,3 % de las muestras de Diacol-Capiro y Criolla Colombia, respectivamente. Su identidad fue confirmada por IC-RT-qPCR, con valores de ciclo umbral (Ct) de 15,04 a 27,59 y dos temperaturas de fusión (Tm) (Tm1 = 80,3 °C ± 0,5 y Tm2 = 83,3 °C ± 0,5), encontrándose así dos variantes de PVX en Antioquia. Utilizando NGS se detectó el PVX en bajos niveles de infección en las muestras de Criolla Colombia, siendo posible obtener contigs parciales para todos los ORFs del genoma viral. Con NGS no se detectó el virus en las muestras de Diacol-Capiro evaluadas. Los análisis filogenéticos realizados con base en secuencias de cápside y replicasa viral separaron los aislamientos de PVX de Antioquia en dos grupos, relacionados con el clado Eurasiático (I) de este virus. Los altos niveles de infección de PVX detectados en los cultivos de papa de Antioquia y la ocurrencia de al menos dos variantes, enfatizan en la necesidad de fortalecer los programas de certificación de tubérculos-semilla de papa, como principal herramienta para el control de este virus.
In this study, the phylogenetic relationships and molecular variability of PVX isolates from leaf samples of Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro and S. phureja var. Criolla Colombia in Antioquia were analyzed. Sequences were obtained using Next Generation Sequencing (NGS) of bulk samples and Sanger sequencing. DAS-ELISA (Agdia-PSA10000) revealed infection levels of 14.7 % and 13.3 % leaf samples of Diacol-Capiro and Criolla Colombia, respectively. The presence of PVX was further confirmed by IC-RT-qPCR in eight samples, which resulted in Ct values in the 15.04-27.59 range and two melting temperatures (Tm1 = 80.3 °C ± 0.5 and Tm2 = 83.3 °C ± 0.5). These results suggest the presence of at least two PVX variants in Antioquia. Using NGS, PVX was detected at low levels in leaf samples of Criolla Colombia, which resulted in contigs for most ORFs of the viral genome; NGS did not detect PVX in Diacol-Capiro samples. Phylogenetic analysis using capsid and replicase sequences separated PVX isolates into two groups within the Eurasian class (I). The high levels of PVX infection detected in potato crops in Antioquia and the presence of at least two variants highlight the need to strenghten current tuber seed certification programs aimed at controlling the spread of this virus.
ABSTRACT
Con el objetivo de evaluar la diversidad genética de Solanum spp. del distrito de Chungui, La Mar, Ayacucho, se colectaron 25 morfotipos de papas nativas los cuales fueron introducidos y micropropagados en el medio de cultivo Murashigue Skoog (1962). La extracción de ADN se procedió utilizando el método CTAB modificado a partir de hojas de 3 semanas cultivo, se logró buena calidad y cantidad de ADN para emplear el AFLP. La digestión enzimática del ADN se realizó utilizando EcoRI y MseI. Se emplearon tres combinaciones de primers AFLP con tres nucleótidos selectivos, originándose un total de 85 bandas claramente diferenciables, de las cuales 63 fueron polimórficas. La combinación E37 - M50 fue la más informativa obteniendo un índice de contenido polimórfico de 0.43. La lectura de la presencia o ausencia de bandas polimórficas de los morfotipos evaluados empleando el coeficiente de similitud Simple Matching y el análisis de agrupamiento según el algoritmo UPGMA originó un dendograma con un índice de correlación cofenética de r= 0.7. El dendograma con un coeficiente de similitud de 0.64 agrupó a los morfotipos de papas nativas en 4 grupos genéticos y no se encontró morfotipos duplicados a pesar de tener algunas características morfológicas muy semejantes. Estos resultados demuestran el alto poder informativo de los marcadores AFLP en el análisis de la diversidad genética de papas nativas.
Genetic diversity of 25 morphotypes of native potatoes Solanum spp. from Chungui (La Mar, Ayacucho) were assess. Morphotypes collected were micropropagated in Murashigue Skoog medium (1962). DNA extraction proceeded using the CTAB method modified from 3 weeks leaves crop, good quality and quantity of DNA was able to use the AFLP. Enzymatic digestion of the DNA was performed using EcoRI and MseI. Three combinations of AFLP primers with three selective nucleotides were used, resulting in a total of 85 clearly discernable bands, of which 63 were polymorphic. The combination E37 - M50 showed the most informative polymorphic index content of 0.43. The presence/absence of polymorphic bands was evaluated using the Simple Matching coefficient similarity and clustering analysis using the UPGMA. The dendrogram produced had a cophenetic correlation coefficient r= 0.7. At the level 0.64 of Simple Matching coefficient similarity, the dendrogram grouped the morphotypes of native potatoes in 4 genetic groups, it not found duplicated morphotypes, despite having some morphotypes very similar. Our results would be showing the highly informative power of AFLP markers for the analysis of genetic diversity of native potatoes.