Desarrollo y validación de un método de suspensión basado en células Vero para la detección del virus Zika / Development and validation of a vero cell-based suspension method for the detection of Zika virus

Objetivo . Desarrollar y validar un método de suspensión celular utilizando células Vero 76 para el cultivo del virus Zika (ZIKV) basado en la infección de células recién sembradas no adheridas. Material y métodos . Se utilizaron tres multiplicidades de infección diferentes del ZIKV para desarrollar y comparar este novedoso método con el método estándar de monocapa de células confluentes. Además, validamos preliminarmente el método de suspensión utilizando muestras clínicas caracterizadas como positivas o negativas para el ZIKV. El método estándar de monocapa se utilizó como método de referencia, y el aislamiento viral se confirmó mediante un RT-PCR específico del ZIKV. Se estimó la sensibilidad e intervalos de confianza del 95% para el método de suspensión. Asimismo, se realizó una comparación técnica del método de suspensión contra el método de monocapa. Resultados . Nuestros hallazgos sugieren que tanto la carga viral como la replicación del ZIKV fueron comparables entre los métodos de infección en monocapa y en suspensión. Aunque ambos métodos fueron adecuados para cultivar y aislar el ZIKV, el método de suspensión se caracterizó por ser más fácil, barato y rápido, así como una técnica de aislamiento sensible. En comparación con el método de monocapa, el método de suspensión fue cuatro veces más sensible en la detección del ZIKV en casos inconclusos por RT-PCR. Conclusiones . El método de suspensión tiene el potencial de ser un método eficaz para cultivar y aislar el ZIKV y su uso es potencialmente útil tanto en la investigación como en entornos clínicos.

Objective. To develop and validate a cell suspension method using Vero 76 cells for culturing Zika virus (ZIKV) based on infection of detached freshly seeded cells. Material and methods. Three different multiplicities of infection of ZIKV were used to develop and compare this novel method to the standard confluent cell monolayer method. In addition, we preliminary validated the cell suspension method using well-characterized ZIKV positive and negative clinical samples. The standard confluent cell monolayer method was used as the reference method, and viral isolation was confirmed by a ZIKV-specific RT-PCR. The sensitivity and its 95% confidence intervals for the cell suspension method were estimated. Also, a technical comparison of the cell suspension method against the cell monolayer method was performed. Results. Our findings suggested that both the viral load and replication of ZIKV were comparable between both monolayer- and suspension-infection methods. Although both methods were suitable for culturing and isolating ZIKV, the cell suspension method was easier, cheaper, and quicker as well as a sensitive isolation technique. The cell suspension method was significantly more sensitive in detecting Zika in inconclusive cases by RT-PCR, with a fourfold increase compared to the confluent cell monolayer method. Conclusion. The cell suspension method has the potential to be an effective method for cultivating and isolating ZIKV and its application is potentially useful in both research and clinical settings.

Efeito da terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura celular de fibroblastos / Efecto del ultrasonido de baja intensidad en cultivo celular de fibroblastos / Effect of low-intensity pulsed ultrasound therapy on a fibroblasts cell culture

Dentro da prática fisioterápica verifica-se a ampla utilização do ultrassom terapêutico para tratamento das diversas afecções musculoesqueléticas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade, com diferentes regimes de pulsos e intensidade, em cultura celular de fibroblastos L929 (ATCC CCL-1 NCTC), de modo a verificar a viabilidade celular e definir parâmetros de dosimetria. Para isso, utilizou-se a aplicação de ultrassom pulsado, com frequência de 1Mhz, em cultura de células fibroblásticas, divididas em cinco grupos (controle e com intensidade instantâneas de 0,3W/cm2-10%; 0,3W/cm2 -20 %; 0,5W/cm2 -10% e US 0,5W/cm2 -20 % - 100Hz). A irradiação ocorreu com intervalos de 24, 48 e 72 horas, por dois minutos, e após 24 horas de cada irradiação foi realizado teste de MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]. Os resultados revelaram que ao compararem-se os valores de células viáveis pelo método MTT nos cinco grupos, não foi possível encontrar diferença estatisticamente significativa em nenhum deles, nos três momentos avaliados (24, 48 e 72 horas); enquanto que, ao se realizar a análise de medida repetida nos diferentes grupos, encontrou-se diferença estatisticamente significativa apenas no grupo irradiado com ultrassom a 0,5W/ cm2com regime de pulso de 10% (p=0,003). Com base nesses resultados, conclui-se que a irradiação Ultrassônica de Baixa Intensidade em cultura celular de fibroblastos L929, somente no grupo com intensidade de 0,5W/cm2-10% obteve o crescimento numérico, com significância estatística em todos os períodos de avaliação.

En la práctica fisioterápica se utiliza bastante el ultrasonido como terapia para el tratamiento de diversos trastornos muscoloesqueléticos. Este artículo tiene por objetivo evaluar el efecto de la irradiación ultrasónica de baja intensidad, con diferentes regímenes de pulsos y de intensidades, en cultivo celular de fibroblastos L929 (ATCC CCL-1 NCTC), para verificar la viabilidad celular y establecer los parámetros de dosimetría. Se utilizó el ultrasonido pulsado, con frecuencia de 1Mhz, en un cultivo de células fibroblásticas, divididas en cinco grupos (con control y con la intensidad instantánea del 0,3W/cm2-10%; 0,3W/cm2 -20%; 0,5W/cm2 -10% y US 0,5W/cm2-20 % - 100Hz). La irradiación se llevó a cabo en intervalos de 24, 48 y 72 horas, durante dos minutos y después de las 24 horas de cada irradiación se realizó la prueba de MTT {Bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]}. Los resultados mostraron que en la comparación entre los valores de células viables por el método MTT en los cinco grupos evaluados no ha sido posible encontrar ninguna diferencia estadísticamente significativa en los tres momentos evaluados (24, 48 y 72 horas). En cambio, al llevar a cabo el análisis de medida repetida en los diferentes grupos, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa solamente en el grupo irradiado con ultrasonido a 0,5W/cm2 con el régimen de pulso del 10% (p=0,003). Basándose en estos resultados se concluyó que la irradiación ultrasónica de baja intensidad en cultivo celular de fibroblastos L929 obtuvo el aumento sólo en el grupo con intensidad de 0,5W/cm2-10%, con significancia en todos los periodos de evaluación.

Within the physiotherapy practice there is a wide use of therapeutic ultrasound for the treatment of various musculoskeletal disorders. The aim of this study was to evaluate the effect of Low Intensity Ultrasonic irradiation with differents forms of pulse and intensity in cell culture of L929 fibroblasts (ATCC CCL-1 NCTC), in order to check cell viability and define parameters of dosimetry. For this purpose, it was used the application of pulsed ultrasound with a frequency of 1MHz in cultured fibroblast cells divided into five groups (control and instantaneous intensity of 0.3W/cm2-10%, 0.3W/cm2 -20%, 0.5W/cm2-10% and US 0.5W/cm2-20% - 100Hz). Irradiation occurred at intervals of 24, 48 and 72 hours for two minutes and 24 hours after each irradiation test MTT [3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] was performed. Results showed that when comparing the values of viable cells by MTT method in the five groups, we could not find statistically significant difference in any of them, in these three conditions (24, 48 and 72 hours); while. Whereas, when performing the analysis of repeated measures in the different groups, it was found a statistically significant difference only in the group irradiated with ultrasound at 0.5W/cm2 with pulse regime of 10% (p=0.003). Based on these results, it is concluded that the Low Intensity Ultrasonic irradiation in L929 fibroblast cell culture, only in the group with an intensity of 0.5W/cm2 -10% obtained numerical growth, with statistical significance in all periods evaluation.

Cultivo de células madre limbares en membrana amniótica para reconstrucción de tejido corneal: una comparación de dos métodos / Limbal stem cell culture on amniotic membrane for corneal tissue reconstruction: a comparison of techniques / Cultivo de células mãe limbares em membrana amniótica para reconstrução de tecido corneano: uma comparação de dois métodos

Objetivo: Obtener un cultivo celular de células del limbus corneal en membrana amniótica como soporte por dos métodos diferentes, suspensión y explante, para obtener datos de confluencia, viabilidad y diferenciación en ambos métodos. Métodología: Muestras de LSC (limbal stem cells, por sus siglas en inglés) fueron obtenidas de 16 donantes cadavéricos. Se realizaron seis cultivos de cada muestra, 3 por el método de suspensión y 3 por el método de explante, todo por triplicado. Como control negativo se utilizó membrana amniótica sin LSCs. Las células fueron cultivadas con SHEM, 37°C, 5% CO2 y 95% de humedad. Los cultivos fueron mantenidos por 14 días con un recambio de medio cada 3 días. El día 14 los cultivos fueron analizados para evaluar viabilidad con azul de tripano, confluencia por microscopio y la diferenciación celular con Inmunohistoquímica para detectar citoqueratina 3/12. Resultados: Como resultado de los experimentos mencionados anteriormente, para los métodos de suspensión y explante, se encontró una viabilidad de 98.92% y 98.32%, una confluencia de 55.95% y 48.27%, una concentración celular de 38.83x104 células/ml y 36.484x104 celulas/ml, y una diferenciación de 22.93% y 16.55%, respectivamente. Conclusiones: Aunque éste estudio compare dos métodos, cultivos en suspensión de LSC y cultivo en explante de LSC, ambos con membrana amniótica como soporte, nosotros encontramos una pequeña diferencia en ellos. Como resultado, el cultivo en suspensión fue mejor que el explante, sin embargo los resultados no son conclusivos, por lo tanto es necesario realizar más investigaciones en este campo para lograr una conclusión con respecto al desempeño de estos dos métodos.

Objective: To grow cells on amniotic membrane corneal limbus with two different methods to assess the confluence, viability and differentiation of both.Methods: LSC samples were obtained from 16 deceased donors. Additionally, six cultures were made from each sample, 3 by LSC suspension method and 3 by LSC explant method, all in triplicate. Furthermore, AMs without oral mucosal cells were used as negative control cultures. The cells were seeded with SHEM, 37°C, 5% CO2, 95% humidity. Moreover, the cultures were maintained for 14 days and the culture medium was changed every other day or every 3 days. Also, on the 14th day, the cultures were analyzed to evaluate viability with trypan blue, confluence with microscopy and cell differentiation with immunohistochemistry to detect cytokeratin 3/12.Results: As a result of the experiments mentioned above, for suspension and explant cultures, we found a viability of 98.92% and 98.32%, a confluence of 55.95% and 48.27%, a final cellular concentration of 38.83x104 cells/ml and 36.484x104 cells/ml, and a differentiation of 22.93% and 16.55%, respectively.Conclusions: Although this study compared two methods, LSC suspension culture and LSC explant culture, both with AM as scaffold, we did find a slight difference between them. As a result, the suspension culture was better than the LSC explant culture, but the results are not conclusive. It is necessary to conduct more research in this field to reach a conclusion regarding the behavior of these two methods

Objetivo: Obter um cultivo celular de células do limbus corneano em membrana amniótica como suporte por dois métodos diferentes, suspensão e explante, para obter dados de confluência, viabilidade e diferenciação em ambos métodos. Métodos: Mostras de LSC (limbal stem cells, por suas siglas em inglês) foram obtidas de 16 doadores cadavéricos. Realizaram-se seis cultivos de cada mostra, 3 pelo método de suspensão e 3 pelo método de explante, tudo por triplicado. Como controle negativo se utilizou membrana amniótica sem LSCs. As células foram cultivadas com SHEM, 37°C, 5% CO2 e 95% de umidade. Os cultivos foram mantidos por 14 dias com uma troca de meio cada 3 dias. O dia 14 os cultivos foram analisados para avaliar viabilidade com azul de tripan, confluência por microscópio e a diferenciação celular com Imunoistoquímica para detectar citoqueratina 3/12. Resultados: Como resultado dos experimentos mencionados anteriormente, para os métodos de suspensão e explante, encontrou-se uma viabilidade de 98.92% e 98.32%, uma confluência de 55.95% e 48.27%, uma concentração celular de 38.83x104 células/ml e 36.484x104 células/ml, e uma diferenciação de 22.935% e 16.558%, respectivamente. Conclusão: Ainda que este estudo compare dois métodos, cultivos em suspensão de LSC e cultivo em explante de LSC, ambos com membrana amniótica como suporte, nós encontramos uma pequena diferença neles. Como resultado, o cultivo em suspensão foi melhor do que o explante, no entanto os resultados não são conclusivos, portanto é necessário realizar mais investigações neste campo para conseguir uma conclusão com respeito ao desempenho destes dois métodos